Projekt okładki i stron tytułowych Lidia Michalak

Ilustracja na okładce Dr Jeremy Burgess/Science Photo Library/Indigo Images

Wydawca Katarzyna Włodarczyk-Gil

Redakcja i korekta Agnieszka Janowska

Koordynator ds. redakcji Renata Ziółkowska

Koordynator produkcji Adam Krajewski

Skład wersji elektronicznej na zlecenie Wydawnictwo Naukowe PWN: Michał Latusek

Książka, którą nabyłeś, jest dziełem twórcy i wydawcy. Prosimy, abyś przestrzegał praw, jakie im przysługują. Jej zawartość możesz udostępnić nieodpłatnie osobom bliskim lub osobiście znanym. Ale nie publikuj jej w internecie. Jeśli cytujesz jej fragmenty, nie zmieniaj ich treści i koniecznie zaznacz, czyje to dzieło. A kopiując jej część, rób to jedynie na użytek osobisty.

Szanujmy cudzą własność i prawo.

Więcej na www.legalnakultura.pl .

Polska Izba Książki

Copyright © by Wydawnictwo Naukowe PWN SA

Warszawa 2003, 2022

ISBN 978-83-01-22247-5

DOI: https://doi.org/10.53271/2022.039

eBook został przygotowany na podstawie wydania papierowego z 2022r. (wyd. II)

Warszawa 2022

Wydawnictwo Naukowe PWN SA

02-460 Warszawa, ul. Gottlieba Daimlera 2

tel. 22 69 54 321, faks 22 69 54 288

infolinia 801 33 33 88

e-mail: pwn@pwn.com.pl; reklama@pwn.pl

www.pwn.pl

Bezpłatny fragment

Wykaz jednostek

Wykaz skrótów

Wstęp

Teoria komórkowa – wprowadzenie

1. Podstawowe techniki badawcze

1.1. Instrumenty optyczne – mikroskopy świetlne, elektronowe i inne

1.2. Instrumenty pomocnicze dla mikroskopów

1.2.1. Mikrotomy i ultramikrotomy

1.2.2. Urządzenia peryferyczne

1.3. Wybrane techniki badawcze

1.3.1. Techniki histochemiczne

1.3.2. Wykrywanie hydrolaz i dehydrogenaz

1.3.3. Immunocytochemia, immunohistochemia i immunoznakowanie

1.3.4. Hodowla komórek i tkanek in vitro

1.3.5. Zasady autoradiografii

1.3.6. Frakcjonowanie komórek

1.3.7. Elektroforeza żelowa

1.3.8. Reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR)

1.3.9. Mikromacierze

1.3.10. Sekwencjonowanie DNA

1.3.11. Chromatografia

Piśmiennictwo

2. Podstawowe typy komórek i tkanek

2.1. Podstawowe typy tkanek

2.1.1. Komórki nabłonkowe

2.1.2. Tkanka łączna i jej komórki

2.1.3. Komórki mięśni szkieletowych, gładkich i mięśnia sercowego

2.1.4. Komórki nerwowe i glejowe

2.1.5. Komórki krwi

Piśmiennictwo

3. Błona komórkowa

3.1. Podstawowe właściwości błony komórkowej

3.1.1. Podstawowe składniki błony komórkowej

3.1.2. Struktura i topografia lipidów błony komórkowej

3.1.3. Fizykochemiczne właściwości lipidów błonowych

3.1.4. Białkowe składniki błony komórkowej

3.1.5. Cukrowe składniki błony komórkowej

3.2. Specjalizacja i wytwory błony komórkowej

3.2.1. Polaryzacja strukturalno-czynnościowa

3.2.2. Połączenia międzykomórkowe (zamykające, ścisłe, przylegające i szczelinowe)

Piśmiennictwo

4. Organizacja cytoplazmy

4.1. Przedziały wewnątrzkomórkowe – kompartmentacja i transport

4.2. Jądro komórkowe

4.2.1. Macierz jądrowa

4.2.2. Struktura chromatyny

4.2.3. Nukleosomowa budowa chromatyny

4.2.4. Sposób upakowania chromatyny w jądrze komórkowym

4.2.5. Osłonka jądrowa

4.2.6. Inne struktury w jądrze komórkowym

4.2.7. Jąderko

4.2.8. Zwielokrotnienie (amplifikacja) genu rybosomalnego RNA

4.3. Siateczka śródplazmatyczna

4.3.1. Siateczka śródplazmatyczna ziarnista (reticulum cytoplasmaticum granulosum)

4.3.2. Siateczka śródplazmatyczna gładka (reticulum cytoplasmaticum agranulosum)

4.3.3. Składniki błon siateczki śródplazmatycznej

4.3.4. Rola siateczki śródplazmatycznej w procesie syntezy białek

4.3.5. Formowanie się białek w siateczce śródplazmatycznej

4.3.6. Glikozylacja białek w siateczce śródplazmatycznej

4.3.7. Synteza lipidów błon

4.3.8. Stres siateczki śródplazmatycznej

4.3.9. Siateczka sarkoplazmatyczna

4.4. Aparat Golgiego

4.4.1. Elementy strukturalne aparatu Golgiego

4.4.2. Procesy biochemiczne zachodzące w aparacie Golgiego

4.4.3. Udział aparatu Golgiego w dojrzewaniu form prekursorowych białek

4.4.4. Stres aparatu Golgiego

4.4.5. Synteza pektyn i hemicelulozy w aparacie Golgiego roślin

4.5. Transport pęcherzykowy

4.5.1. Transport anterogradowy

4.5.2. Transport retrogradowy

4.5.3. Transport apikalny

4.5.4. Transport bazolateralny

4.5.5. Fuzja pęcherzyków

Piśmiennictwo

5. Degradacja substratów w komórce

5.1. Układ endosomowy

5.1.1. Makropinocytoza (endocytoza fazy płynnej)

5.1.2. Endocytoza związana z białkiem klatryną

5.1.3. Kaweole

5.1.4. Endocytoza niezależna od klatryny i kaweoliny

5.1.5. Fagocytoza

5.1.6. Egzocytoza

5.2. Lizosomy

5.2.1. Struktura błony lizosomowej

5.2.2. Synteza hydrolaz i powstawanie lizosomów

5.2.3. Hydrolazy lizosomowe

5.3. Udział układu lizosomowego w prawidłowym funkcjonowaniu organizmu

5.4. Proteasomowa degradacja białek

5.5. Autofagia – rola w degradacji białek i organelli

5.5.1. Makroautofagia

5.5.2. Mikroautofagia

5.5.3. Autofagia zależna od białek opiekuńczych

5.5.4. Selektywna degradacja składników komórkowych

Piśmiennictwo

6. Transformatory energii (mitochondria i chloroplasty)

6.1. Struktura mitochondriów

6.1.1. Formy i topografia mitochondriów

6.1.2. Ultrastrukturalna organizacja mitochondrium

6.1.3. Główne procesy metaboliczne przebiegające w mitochondriach

6.1.4. Mechanizmy transportu przez błony mitochondrialne

6.1.5. Import białek

6.1.6. Komunikacja mitochondrium z siateczką śródplazmatyczną

6.1.7. Mitochondria jako jednostki samoreplikujące się – biogeneza i pochodzenie

6.2. Chloroplasty jako transformatory energii

6.2.1. Zarys struktury komórki roślinnej

6.2.2. Struktura chloroplastów

6.2.3. Fotosynteza

6.2.4. Wiązanie węgla przez chloroplasty w roślinach typu C₄ i CAM

6.2.5. Biogeneza i pochodzenie chloroplastów

Piśmiennictwo

7. Pierwotne utleniacze – peroksysomy

7.1. Struktura i rola peroksysomów w komórkach zwierzęcych

7.2. Peroksysomy roślinne – glioksysomy

7.2.1. Rola glioksysomów w komórkach roślinnych

7.3. Transport białek do peroksysomów

7.4. Podsumowanie funkcji peroksysomów w komórkach

7.5. Hydrogenosomy

Piśmiennictwo

8. Cykl komórkowy, podział i śmierć komórki

8.1. Cykl komórkowy

8.1.1. Fazy cyklu komórkowego

8.1.2. Starzenie się i śmierć komórki

8.2. Podział komórki – mitoza

8.2.1. Cytokineza

8.3. Podział redukcyjny – mejoza

8.3.1. Fazy podziału redukcyjnego

8.4. Struktura chromosomów

8.4.1. Chromosomy olbrzymie

8.5. Organizacja wrzeciona podziałowego

8.5.1. Elementy strukturalne wrzeciona podziałowego

8.5.2. Typy wrzecion podziałowych

8.5.3. Rola mikrotubul w rozdziale chromosomów podczas anafazy

8.6. Śmierć komórki

8.6.1. Apoptoza

8.6.2. Nekroza

8.6.3. Inne formy śmierci komórkowej

8.7. Mechanizm homeostazy czasowej komórek

8.8. Transformacja nowotworowa komórki

Piśmiennictwo

9. Szkielet komórkowy

9.1. Mikrotubule – struktura i dynamika

9.1.1. Dynamiczna niestabilność mikrotubul

9.1.2. Czynniki komórkowe regulujące formowanie się mikrotubul

9.2. Centriole jako pierwotne struktury mikrotubul

9.3. Rzęski i wici

9.4. Udział mikrotubul w transporcie wewnątrzkomórkowym

9.4.1. Rola dyneiny i kinezyny w kierowaniu transportem

9.5. Filamenty aktynowe – struktura i dynamika

9.5.1. Polimeryzacja aktyny

9.5.2. Białka regulujące polimeryzację filamentów aktynowych

9.5.3. Miozyna – białko motoryczne filamentów aktynowych

9.5.4. Procesy regulujące formowanie się filamentów miozynowych

9.6. Wyspecjalizowane układy aktynowo-miozynowe – mięśnie poprzecznie prążkowane

9.6.1. Geneza i organizacja sarkomeru mięśni poprzecznie prążkowanych

9.6.2. Białka regulujące skurcz sarkomeru

9.6.3. Siateczka sarkoplazmatyczna i kanaliki systemu T a skurcz sarkomeru

9.6.4. Etapy wyzwalające skurcz sarkomeru

9.7. Wyspecjalizowane układy aktynowo-miozynowe – mięśnie gładkie

9.7.1. Struktura miocytu gładkiego

9.7.2. Struktura i regulacja aparatu kurczliwego miocytów gładkich

9.8. Filamenty pośrednie – struktura

9.8.1. Białka filamentów pośrednich

9.8.2. Białka towarzyszące filamentom pośrednim

Piśmiennictwo

Przypisy

Wykaz jednostek

DŁUGOŚĆ (l)

1 m (metr, podstawowa jednostka długości)

1 dm (decymetr)

= 10–1 m

1 cm (centymetr)

= 10–2 m

1 mm (milimetr)

= 10–3 m

1 μm (mikrometr)

= 10–6 m

1 nm (nanometr)

= 10–9 m

1 Å (angstrem)

= 10–10 m

MASA (m)

1 kg (kilogram, podstawowa jednostka masy)

1 g (gram)

= 10–3 kg

1 mg (miligram)

= 10–3 g

1 μg (mikrogram)

= 10–6 g

1 ng (nanogram)

= 10–9 g

OBJĘTOŚĆ (v)

1 m³ (metr sześcienny, podstawowa jednostka objętości)

1 dm³ (decymetr sześcienny)

= 1 l (litr)

= 10–3 m³

1 ml (mililitr)

= 10–3 l

= 10–2 m³

= 1 cm³

1 μg (mikrolitr)

= 10–6 l

= 10–3 m³

= 1 mm³

1 ng (nanolitr)

= 10–9 l

= 10–9 m³

STĘŻENIE

1 M (molarne)

= 1 mol/dm–3 = 6,02·1023 cząsteczek/dm³

1 mM (milimolarne)

= 10–3 M

1 μM (mikromolarne)

= 10–6 M

1 nM (nanomolarne)

= 10–9 M

CIŚNIENIE (p); w układzie SI jednostką ciśnienia jest paskal

1 Pa

= 1 N/m⁻² = 1 kg/m·s² (N – niuton, siła działająca prostopadle na powierzchnię 1 m²)

1 hPa (hektopaskal)

= 10² Pa

1 kPa (kilopaskal)

= 10³ Pa

1 MPa (megapaskal)

= 10⁶ Pa

ATMOSFERA (atm) I MILIMETR SŁUPA RTĘCI (Hg)

Jednostki stosowane, ale nie należące do układu SI:

1 atm (atmosfera)

= 760 mm Hg

1 atm

= 101 325 Pa

= 1013 hPa

= 101,3 kPa

1 mm Hg

= 1/760 atm

1 mm Hg

= 133,322 Pa

= 1,333 hPa

= 0,1333 kPa

TEMPERATURA (T, t)

Stosuje się dwie skale: stustopniową Celsjusza (°C) i bezwzględną Kelvina (K)

0 K = –273,15°C

0°C = 273,15 K

CHEMICZNE JEDNOSTKI MASY

Względne wartości mas atomów i cząsteczek są wielkościami niemianowanymi, odniesione do 1/12 masy atomu izotopu węgla ¹²C. Umownie przyjętą jednostkę masy atomowej i cząsteczkowej oznacza się jako u lub j.m.a. (jednostka węglowa). Względna masa atomu lub cząsteczki wskazuje, ile razy jest ona większa od jednostki masy atomowej u.

u = 1,66·10–24 g

STAŁE I PRZELICZENIA

1 mol

= 6,02·10²³ cząsteczek (jonów, atomów, elektronów)

1 cal (kaloria)

= ciepło potrzebne do podwyższenia temperatury 1 g wody o 1°C

1 kcal (kilokaloria)

= 10³ cal = 4,18 kJ (kilodżuli)

1 l (wody)

= 1 kg wody (w temperaturze 4°C)

1 Da (dalton)

= masa jednego atomu wodoru (~1,7·10–24 g)

1 kDa (kilodalton)

= 103 Da

PODSTAWOWE AMINOKWASY

kwas asparaginowy

Asp

D

kwas glutaminowy

Glu

E

arginina

Arg

R

lizyna

Lys

K

histydyna

His

H

asparagina

Asn

N

glutamina

Gln

Q

seryna

Ser

S

treonina

Thr

T

tyrozyna

Tyr

Y

alanina

Ala

A

glicyna

Gly

G

walina

Val

V

leucyna

Leu

L

izoleucyna

Ile

I

prolina

Pro

P

fenyloalanina

Phe

F

metionina

Met

M

tryptofan

Trp

W

cysteina

Cys

C

Wykaz skrótów

ABD – domena wiążąca aktynę (ang. actin-binding domain)

ACN1 – ang. acetate non-utilizing 1

ADAM – białko z domeną dezintegryn i metaloproteinaz (ang. a disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein)

ADF – czynnik depolimeryzujący filamenty aktynowe (ang. actin-depolymerizing factor)

AEE – wczesne endosomy apikalne (ang. apical early endosomes)

ALFY – białko FYVE związane z autofagią (ang. autophagy-linked FYVE protein)

AMPK – kinaza białkowa aktywowana 5'AMP (ang. 5'AMP-activated protein kinase)

AOC – centrum organizacji filamentów aktynowych (ang. actin organizing center)

AP – białko adaptorowe (ang. adaptor protein)

APAF-1 – czynnik aktywujący proteazy apoptotyczne (ang. apoptosis protease-activating factor 1)

APC – białko supresorowe nowotworu (ang. adenomatous polyposis coli tumor suppressor)

APC – kompleks sprzyjający anafazie (ang. anaphase promoting complex)

ARE – recyklizujące endosomy apikalne (ang. apical recycling endosomes)

ARF – czynnik rybozylacji ADP (ang. ADP-ribosylation factor)

ARP – białka stowarzyszone z aktyną (ang. actin related proteins)

ATF6 – czynnik aktywujący transkrypcję 6 (ang. activating transcription factor 6)

ATG – białka związane z autofagią (ang. autophagy-related proteins)

ATM – ang. ataxia telangiectasia mutated

ATP – adenozyno-5'-trójfosforan

ATR – ang. ataxia telangiectasia and Rad3-related protein

BAP31 – ang. B-cell receptor-associated protein 31

BBC – składnik wiążący Bcl-2 (ang. Bcl-2-binding component)

BCL-2 – białko komórek B chłoniaka 2 (ang. B-cell lymphoma 2)

BCL2L13 – ang. BCL2-like protein 13

BCL-xL – ang. B-cell lymphoma-extra large

BEE – endosomy wczesne bazolateralne (ang. basolateral early endosomes)

BH – motyw homologiczny BCL-2 (ang. BCL-2 homology)

BICD – białko adaptorowe dla dyneiny (ang. bicaudal-D)

BID – agonista oddziałujący z domeną śmierci BH3 (ang. BH3 interacting domain death agonist)

BSE – elektrony wstecznie rozproszone (ang. backscattered electrons)

CAB – białko wiążące wapń (ang. calcium binding protein)

CALCOCO2 – ang. calcium binding and coiled-coil domain 2

CAM – ang. crassulacean acid metabolism

cAMP – cykliczny adenozyno-3'5'-monofosforan

CAMSAP – białka zależne od kalmoduliny i spektryny (ang. calmodulin-regulated spectrin-associated protein)

CC – struktura zwiniętej cewki/splecionej spirali (ang. coiled-coil)

CCD – ang. charge-coupled device

CCDC – ang. coiled-coil containing domain proteins

CCG – geny kontrolowane przez zegar (ang. clock-controlled genes)

CCPG1 – gen postępu cyklu komórkowego 1 (ang. cell cycle progression gene 1)

CDE – składnik centromerowy DNA (ang. centromere DNA element)

Cdk – kinaza zależna od cyklin (ang. cyclin-dependent kinase)

CENP – białko centromerowe (ang. centromere protein)

CEP – białko centrosomowe (ang. centrosomal protein)

CEPT – fosfotransferaza cholinowa/etanolaminowa (ang. choline/ethanolamine phosphotransferase)

CERT – transporter ceramidu (ang. ceramide transporter)

CHIP – koniec C białka oddziałującego z HSC70 (ang. carboxyl-terminus of HSC70-interacting protein)

CHMP – białko wypełnionych ciał wielopęcherzykowych (ang. charged multivesicular body protein)

CHOP – homolog białka C/EBP (ang. CAAT/enhancer binding protein (C/EBP) homologous protein)

CHX – wymiennik wapniowo-protonowy (ang. Ca²⁺/H⁺ exchanger)

CIT-K – ang. citron kinase

CLASP – białka stowarzyszone z cytoplazmatycznymi białkami łączącymi CLIP (ang. CLIP-associated protein)

ClC – kanały chlorkowe (ang. Cl– channel)

CLIP – białka łączące chromatydy (ang. chromatid linking proteins)

CLIP – cytoplazmatyczne białka łączące (ang. cytoplasmic linker protein)

CMA – autofagia sterowana białkami opiekuńczymi (ang. chaperone-mediated autophagy)

CMOS – ang. complementary metal oxide semiconductor

COP – białka opłaszczające pęcherzyki (ang. coat proteins)

CPAP – białko P4.1 towarzyszące centrosomowi (ang. centrosomal P4.1-associated protein)

CPC – kompleks pasażera chromosomu (ang. chromosome passenger complex)

CPD – aparat Andersona do suszenia w punkcie krytycznym CO₂ (ang. critical point dryer)

CPX – kompleksyna (ang. complexin)

CRE – endosomy recyklizujące właściwe (ang. common recycling endosomes)

CREB3 – białko 3 wiążące element odpowiedzi na cAMP (ang. cAMP-responsive element-binding protein 3)

DAG – diacyloglicerol (ang. diacylglycerol)

DCX – białko związane z mikrotubulami (ang. doublecortin)

DCTN – dynaktyna (ang. dynactin)

Deptor – białko z domeną DEP oddziałujące z mTOR (ang. DEP domain-containing mTOR-interacting protein)

DFCP1 – białko zawierające podwójną domenę FYVE 1 (ang. double FYVE domain-containing protein 1)

DHC – ciężki łańcuch dyneiny (ang. dynein heavy chain)

DHPRs – receptory dwuhydropirydynowe (ang. dihydropiridine receptors)

DIC – pośredni łańcuch dyneiny (ang. dynein intermediate chain)

DISC – kompleks sygnalizacyjny indukujący śmierć (ang. death inducing signaling complex)

DLC – lekki łańcuch dyneiny (ang. dynein light chain)

DLIC – pośredni lekki łańcuch dyneiny (ang. dynein light intermediate chain)

DNA – kwas deoksyrybonukleinowy

DR – receptor śmierci (ang. death receptor)

DRP1 – białko pokrewne dynaminie 1 (ang. dynamin-related protein 1)

DUB – deubikwitynaza

EB – białka wiążące koniec mikrotubul (ang. end binding)

ECM – macierz zewnątrzkomórkowa (ang. extracellular matrix)

EF1A – czynnik elongacyjny 1 alfa (ang. elongation factor 1 alpha)

eIF2 – eukariotyczny czynnik inicjujący translację 2 (ang. eukaryotic initiation factor 2)

EM-CCD – ang. electron multiplying CCD

EOR – odpowiedź na przeładowanie siateczki śródplazmatycznej białkami (ang. ER-overload response)

ERAD – system degradacji białek związany z siateczką śródplazmatyczną (ang. endoplasmic reticulum associated degradation)

ERES – strefa „wyjścia” siateczki śródplazmatycznej (ang. endoplasmic reticulum exit site)

ERGIC – strefa ratunkowa/pośrednia między siateczką śródplazmatyczną i aparatem Golgiego (ang. ER-to-Golgi intermediate compartment)

ESCRT – endosomowy kompleks sortujący wymagany przy transporcie (ang. endosomal sorting complex required for transport)

ESEM – skaningowy mikroskop elektronowy środowiskowy (ang. environmental scanning electron microscope)

FAD – dwunukleotyd flawinoadenylowy

FADD – białko Fas związane z domeną śmierci (ang. Fas-associated protein with death domain)

FAP – białko związane z witką (ang. flagellar associated protein)

FEG – działo elektronowe z emisją polową (ang. field emission gun)

FFAT – motyw dwóch alanin (FF) w ciągu kwaśnych aminokwasów (ang. two phenylalanines (FF) in an acidic tract)

FHDC – białka zawierające domenę FH2 (ang. FH2 domain containing protein)

FIS1 – białko rozszczepiające 1 (ang. fission protein 1)

FIP200 – ang. focal adhesion kinase family kinase-interacting protein 200 kDa

FLIP – białko inhibitorowe FLICE (ang. FLICE-inhibitory protein)

FMN – mononukleotyd flawinowy

Fuc – fukoza

FUNDC1 – białko 1 zawierające domenę FUN14 (ang. FUN14 domain-containing protein 1)

G– – bakterie Gram-ujemne

G+ – bakterie Gram-dodatnie

GA – kwas glikolowy

GABARAP – białko związane z receptorem GABA (ang. GABA receptor-associated protein)

GADD153 – białko indukowane uszkodzeniami DNA i zatrzymaniem wzrostu 153 (ang. growth arrest and DNA damage inducible 153 protein)

GAG – glikozaminoglikany

Gal – galaktoza

GATE16 – ang. Golgi-associated ATPase enhancer of 16 kD

GalUA – kwas galakturonowy

GAP – białko aktywujące nukleotydy guaninowe (ang. guanine activating protein)

GCN2 – ang. general control non-derepresible 2

GDI – czynnik hamujący GDP (ang. GDP-inhibiting factor)

GEF – czynnik wymiany nukleotydów guaninowych (ang. guanine nucleotide exchange factor)

GFAP – kwaśne włókienkowe białko glejowe (ang. glial fibrillary acidic protein)

GFP – białko zielonej fluorescencji (ang. green fluorescent protein)

GL – kwas glicerynowy

GlcNAc – N-acetyloglukozamina

GLUT – transporter glukozy (ang. glucose transporter)

GM – białko-znacznik aparatu Golgiego (ang. Golgi marker)

GOLPH – fosfoproteina aparatu Golgiego (ang. Golgi phosphoprotein)

GOMED – degradacja związana z błonami aparatu Golgiego (ang. Golgi membrane-associated degradation)

GPAD – transferaza acylowa glicero-3-fosforanu (ang. glycerol-3-phosphate acyl transferase)

GP – glikoproteina

GPI – glikozylofosfatydyloinozytol (ang. glycosylphosphatidylinositol)

GPI-AP – białka wyposażone w kotwicę z glikozylofosfatydyloinozytolu (ang. GPI-anchor protein)

GPCR – receptory związane z białkami G (ang. G-protein coupled receptors)

GPX – peroksydaza glutationowa (ang. glutathione peroxidase)

GRASP – białka układające stosy cystern aparatu Golgiego (ang. Golgi reassambly and stacking proteins)

GRP – białko regulowane glukozą (ang. glucose-regulated protein)

GTP – guanozyno-5'-trójfosforan

GXA – kwas glioksalowy

HMM – meromiozyna ciężka (ang. heavy meromyosin)

hnRNA – heterogenny, jądrowy RNA (ang. heterogeneous nuclear RNA)

HPF – zamrażanie w wysokim ciśnieniu (ang. high pressure freezing)

HPLC – cieczowa chromatografia wysokociśnieniowa (ang. high-pressure liquid chromatography)

HRS – substrat kinazy tyrozynowej regulowany HGF (ang. HGF-regulated tyrosine kinase substrate)

HSC – białko pokrewne białkom szoku cieplnego (ang. heat shock cognate)

HSP – białko szoku cieplnego (ang. heat shock protein)

ICD – choroba komórek I (ang. inclusion cell disease)

IFAP – białka związane z filamentami pośrednimi (ang. intermediate filament-associated proteins)

Ig – immunoglobulina

IGC – klastry ziaren międzychromatynowych (ang. interchromatin granule clusters)

IGF-1 – insulinopodobny czynnik wzrostu 1 (ang. insulin-like growth factor 1)

INCNP – białko centromerowe wewnętrzne (ang. inner centromere protein)

IP3 – 1,4,5-trójfosforan inozytolu (ang. inositol 1,4,5-triphosphate)

IRE1 – enzym wymagający inozytolu 1 (ang. inositol requiring enzyme 1)

ITF – białko transportu wewnątrzwiciowego (ang. intraflagellar transport protein)

JIP – białko oddziałujące z JNK (ang. JNK-interacting protein)

JMY – białko regulujące i pośredniczące w połączeniach (ang. junction-mediating and -regulatory protein)

jSR – łącząca siateczka sarkoplazmatyczna (ang. junctional sarcoplasmic reticulum)

KHC – łańcuch ciężki kinezyny (ang. kinesin heavy chain)

KIF – białka z rodziny kinezyn (ang. kinesin family)

KLC – łańcuch lekki kinezyny (ang. kinesin light chain)

LAMP – białko związane z błoną lizosomu (ang. lysosome associated membrane protein)

LAP – białka związane z laminami (ang. lamina associated polypeptides)

LBPA – kwas lizobisfosfatydowy (ang. lysobisphosphatidic acid)

LBR – receptor laminy B (ang. lamin B receptor)

LC – łańcuch ciężki (ang. light chain)

LDL – lipoproteiny o małej gęstości (ang. low-density lipoprotein)

LGP – glikoproteiny lizosomowe (ang. lysosomal glycoproteins)

LHC – kompleks zbierający światło (ang. light harvesting complex)

LHCP – białko wiążące chlorofil a/b zbierający światło (ang. light harvesting chlorophyll a/b protein)

LIR – region oddziaływania z LC3 (ang. LC3-interacting region)

LIS – lizencefalia (ang. lissencephaly)

LMM – meromiozyna lekka (ang. light meromyosin)

LN₂ – ciekły azot (ang. liquid nitrogen, N₂)

LSCM – laserowy, skanujący mikroskop konfokalny (ang. laser scanning confocal microscope)

LSFM – mikroskop fluorescencyjny arkusza światła  (ang. light sheet fluorescence microscopy)

LTK – leukocytarna kinaza tyrozynowa (ang. leukocyte tyrosine kinase)

LTPs – białka przenoszące lipidy (ang. lipid-transport proteins)

LV-SEM – skaningowa mikroskopia elektronowa niskiej próżni (ang. low-vacuum scanning electron microscopy)

M6P – mannozo-6-fosforan (ang. mannose-6-phosphate)

M6PR – receptor mannozo-6-fosforanu (ang. mannose-6-phosphate receptor)

MACF – czynnik wiążący mikrotubule z aktyną (ang. microtubule-actin crosslinking factor)

MAM – błony stowarzyszone z błonami mitochondrium (ang. mitochondria-associated membranes)

MAP – białka towarzyszące mikrotubulom (ang. microtubule-associated proteins)

MAPK – kinaza białkowa aktywowana mitogenem (ang. mitogen-activated protein kinase)

MAP1LC3 – białko 1 towarzyszące mikrotubulom z łańcuchem lekkim 3 (ang. microtubule-associated protein 1 light chain 3)

MAR – rejony kotwiczenia DNA do macierzy jądrowej (ang. matrix attachment regions)

MBP – białka wiążące MAR (ang. MAR binding proteins)

MCL-1 – ang. myeloid cell leukaemia-1

MCS – miejsca kontaktu błonowego (ang. membrane contact site)

MFP – białko wielofunkcyjne (ang. multifunctional protein)

MIP – białka wewnętrzne mikrotubul (ang. microtubule inner proteins)

MLKL – ang. mixed lineage kinase domain-like protein

mLST8 – ang. mammalian lethal with SEC13 protein 8

MLX – MAX podobne białko X (ang. MAX-like protein X)

MPF – czynnik inicjujący dojrzewanie (ang. maturation promoting factor)

MPP – peptydaza przetwarzająca macierz (ang. matrix processing peptidase)

mRNA – informacyjny, matrycowy (ang. messenger) kwas rybonukleinowy

MTC – wieloskładnikowy kompleks wiążący (ang. multisubunit tethering complex)

MTOC – centrum organizacji mikrotubul (ang. microtubule organizing center)

mTORC – ang. mechanistic target of rapamycin complex

MVB – ciała wielopęcherzykowe (ang. multivesicular bodies)

MyBP – białko wiążące miozynę (ang. myosin binding protein)

M6PR – receptor mannozo-6-fosforanu (ang. mannose-6-phosphate receptor)

NA – apertura numeryczna (ang. numerical aperture)

NAD – dwunukleotyd nikotynoamidoadeninowy

NAADP – fosforan dwunukleotydu adeninowego kwasu nikotynowego (ang. nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate)

NANA – kwas N-acetyloneuraminowy (kwas sialowy)

NBR1 – sąsiad genu BRCA1 1 (ang. neighbor of BRCA1 gene 1)

NCX – wymiennik sodowo-wapniowy (ang. Na⁺/Ca²⁺ exchanger)

N-DRC – neksynowo-dyneinowy kompleks regulacyjny (ang. nexin-dynein regulatory complex)

NDE – ang. nuclear distribution protein nudE-like

NES – sygnał eksportu jądrowego (ang. nuclear export signal)

NF – filamenty pośrednie komórek nerwowych, tzw. neurofilamenty (ang. neurofilament)

NHE – wymiennik sodowo-protonowy (ang. Na⁺/H⁺ exchanger)

NIR2 – ang. Pyk2 N-terminal domain-interacting receptor 2

NKCC – transporter sodowo-potasowo-chlorkowy (ang. Na-K-Cl cotransporter)

NLR – receptory NOD-podobne (ang. NOD-like receptors)

NLS – sygnał lokalizacji jądrowej (ang. nuclear localization signal)

NOR – rejon organizacji jąderka (ang. nucleolar organizing region)

NPC – choroba Niemanna-Picka typu C (ang. Niemann-Pick disease, type C)

NPF – czynnik inicjujący polimeryzację mikrotubul/mikrofilamentów (ang. nucleation-promoting factor)

NSF – czynnik wrażliwy na N-etylomaleimid (ang. N-ethylmaleimid sensitive factor)

nSR – siatkowata siateczka śródplazmatyczna (ang. network sarcoplasmic reticulum)

NUFIP1 – ang. nuclear fragile X mental retardation-interacting protein 1

OGA – enzym O-transferaza N-acetyloglukozaminy

ORF – otwarte ramki odczytu (ang. open reading frame)

ORI – początek replikacji (ang. origin of replication)

ORP – białka zbliżone do OSBP (ang. OSBP-related protein)

OSBP – białka wiążące oksysterole (ang. oxysterol binding protein)

OST – transferaza oligosacharydowa (ang. oligosaccharyl transferase)

3PGL – 3-fosforan gliceryny

PAFAH – ang. platelet-activating factor acetylhydrolase

PALM – ang. photoactivated localization microscopy

PARP-1 – polimeraza poli-ADP rybozy 1 [ang. poly-(ADP-ribose) polymerase-1]

PCD – programowana śmierć komórki (ang. programmed cell death)

PCM – materiał okołocentriolowy (ang. pericentriolar material)

PDGF – płytkopochodny czynnik wzrostu (ang. platelet-derived growth factor)

PDI – izomeraza dwusiarczkowa (ang. protein disulfide isomerase)

PDLSC – komórki macierzyste ozębnej (ang. periodontal ligament stem cells)

PERK – kinaza białkowa siateczki śródplazmatycznej aktywowana RNA [ang. protein kinase RNA-activated (PKR)-like ER kinase]

PEX – peroksyny (ang. peroxines)

PGA – kwas fosfoglikolowy

PH – domena białkowa homologiczna plekstrynie (ang. pleckstrin homology)

PI3K – kinaza 3-fosforanu fosfatydyloinozytolu (ang. phosphatidylinositol-3-phosphate kinase)

PI3P – 3-fosforan fosfatydyloinozytolu (ang. phosphatidylinositol-3-phosphate)

PI4P – 4-fosforan fosfatydyloinozytolu (ang. phosphatidylinositol-4-phosphate)

PI(3,4,5)P – trójfosforan 3,4,5-fosfatydyloinozytolu (ang. phosphatidylinositol-3,4,5-phosphate)

PIK3R4 – podjednostka regulatorowa 4 kinazy 3-fosforanu fosfatydyloinozytolu (ang. PI3K Regulatory Subunit 4)

PIS – syntaza fosfatydyloinozytolu (ang. phosphatidylinositol synthase)

PIT – białka przenoszące fosfatydyloinozytole (ang. phosphatidylinositol transfer protein)

PK – kinaza białkowa (ang. protein kinase)

PLK – kinaza białkowa polopodobna (ang. polo-like kinase)

PMCA – błonowa pompa wapniowa (ang. plasma membrane Ca²⁺ ATPase)

PML – ciałka jądrowe PML (ang. promyelocytic leukemia)

PMP – białka błonowe peroksysomów (ang. peroxisome membrane proteins)

PPB – pierścień preprofazowy (ang. preprophase band)

PPM – fosfatazy białkowe zależne od Mg²⁺/Mn²⁺ (ang. protein phosphatase Mg²⁺/Mn²⁺-dependent)

PRC1 – białkowy regulator cytokinezy 1 (ang. protein regulator of cytokinesis 1)

PS – fotosystem (ang. photosystem)

PSF – funkcja rozkładu intensywności fluorescencji (ang. point spread function)

PSGL-1 – ligand glikoproteinowy P-selektyny 1 (ang. P-selectin glycoprotein ligand 1)

PSS – syntaza fosfatydyloseryny (ang. phosphatidylserine synthase)

PTS – sekwencja kierująca białko do peroksysomów (ang. peroxisome targeting signal)

PUMA – modulator apoptozy regulowany białkiem p53 (ang. p53 upregulated modulator of apoptosis)

PXA – peroksysomowy transporter ABC (ang. peroxisomal ABC transporter)

R1,5BP – rybulozo-1,5-bisfosforan (ang. ribulose 1,5-bisphosphate)

Raptor – ang. regulatory-associated protein of mTOR

rDNA – rybosomowy DNA

RER – siateczka śródplazmatyczna ziarnista/szorstka (ang. rough endoplasmic reticulum)

RETREG – regulator retikulofagii (ang. reticulophagy regulator)

RHD – domena homologiczna retikulonowi (ang. reticulon homology domain)

RHOT – ang. mitochondrial Rho GTPase

RIDD – mechanizm opóźniania syntezy białek zależny od IRE (ang. regulated IRE-dependent decay)

RILP – białko lizosomowe oddziałujące z Rab (ang. Rab-interacting lysosomal protein)

RIPK – kinaza białkowa oddziałująca z receptorem (ang. receptor-interacting protein kinase)

RNA – kwas rybonukleinowy

RNF – rodzina białek z domeną palca RING (ang. RING finger protein family)

RNS – wolne rodniki azotowe (ang. reactive nitrogen species)

ROCK – kinaza białkowa z domeną zwiniętej spirali powiązana z białkiem Rho (ang. Rho-associated coiled-coil containing protein kinase)

ROS – wolne rodniki tlenowe (ang. reactive oxygen species)

rRNA – rybosomowy kwas rybonukleinowy

RSP – białka połączeń promienistych (ang. radial spoke proteins)

RSS – wolne rodniki siarkowe (ang. reactive sulfur species)

RSV – wirus sarkomy Rousa (ang. Rous sarcoma virus)

RTN3 – retikulon 3 (ang. reticulon 3)

RT-PCR – reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją (ang. reverse transcription polymerase chain reaction)

RyRs – receptory rianodinowe (ang. ryanodine receptors)

S1/2P – proteazy aparatu Golgiego (ang. site-1/2 protease)

SAS – białko formujące wrzeciono kariokinetyczne (ang. spindle assambly)

SBF-SEM – ang. serial block-face scanning electron microscopy

SDCM – mikroskop konfokalny z wirującym dyskiem (ang. spinning disc confocal microscope)

SDH – dehydrogenaza bursztynianowa (ang. succinate dehydrogenase)

SDS – siarczan dodecylu sodu

SE – elektrony wtórne (ang. secondary electrons)

SEM – skaningowy mikroskop elektronowy (ang. scanning electron microscope)

SER – siateczka śródplazmatyczna gładka (ang. smooth endoplasmic reticulum)

SERCA – pompa wapniowa zależna od ATP (ang. sarco/endoplasmic reticulum Ca²⁺-ATPase)

SH – homologiczna domena białkowa Src (ang. Src-homology)

SIDT – członek rodziny SID1 białek transbłonowych 2 (ang. SID1 transmembrane family member)

Sig1R – receptor Sigma-1 (ang. Sigma-1 receptor)

SIM – mikroskopia oświetlenia strukturalnego (ang. structured illumination microscopy)

SM – syntaza sfingomielinowa

SNAP – rozpuszczalne białko wiążące NSF (ang. soluble NSF attachment protein)

SNARE – rozpuszczalny receptor białkowy aktywujący czynnik wrażliwy na N-etylomaleimid (ang. soluble N-ethylmaleimid-sensitive factor-activating protein receptor)

snRNA – mały jądrowy RNA (ang. small nuclear RNA)

snRNP – małe jądrowe rybonukleoproteiny (ang. small nuclear ribonucleoproteins)

snoRNP – małe jąderkowe rybonukleoproteiny (ang. small nucleolar ribonucleoproteins)

SOD – dysmutaza ponadtlenkowa (ang. superoxide dismutase)

SPAG – antygen związany z nasieniem (ang. sperm associated antigene)

SPB – ciałka polarne wrzeciona podziałowego (ang. spindle pole bodies)

SPEF – białko wici nasienia (ang. sperm flagellar protein)

SR – siateczka sarkoplazmatyczna (ang. sarcoplasmic reticulum)

SREBP – białko wiążące się do sterolowego elementu regulatorowego (ang. sterol regulatory element binding protein)

SRP – cząsteczka rozpoznająca sekwencję sygnałową (ang. signal recognition particle)

SS – sekwencja sygnałowa

SSEM – ang. serial section scanning electron microscopy

STAM – cząsteczka adaptorowa przeniesienia sygnału (ang. signal transducing adaptor molecule)

STIL – ang. SCL-interrupting locus protein

STK – kinaza serynowo-treoninowa (ang. serine-threonine kinase)

STOP – peptyd hamujący rozpad mikrotubul (ang. stable tubule-only polypeptide)

STORM – mikroskopia stochastycznej rekonstrukcji optycznej (ang. stochastic optical reconstruction microscopy)

STX – syntaksyna (ang. syntaxin)

SUMO – mały, podobny ubikwitynie modyfikator (ang. small ubiquitin-like modifier)

SV40 – ang. simian virus 40

TEM – mikroskop elektronowy transmisyjny (ang. transmission electron microscope)

TFEB – czynnik transkrypcyjny EB (ang. transcription factor EB)

TGN – sieć trans aparatu Golgiego (ang. trans Golgi network)

TIM – kompleks przenoszący błony wewnętrznej mitochondrium (ang. translocating inner membrane complex)

+TIP – białka końca (+) mikrotubul (ang. plus-end-tracking proteins)

TIRF – mikroskopia fluorescencyjna całkowitego wewnętrznego odbicia (ang. total internal reflection fluorescence microscopy)

TLR – receptory Toll-podobne (ang. Toll-like receptors)

TMD – transbłonowy odcinek hydrofobowy (ang. hydrophobic transmembrane domain)

TNF – czynnik martwicy nowotworu (ang. tumor necrosis factor)

TOM – kompleks przenoszący błony zewnętrznej mitochondrium (ang. translocating outer membrane complex)

TPC – kanały dwuporowe (ang. two-pore channels)

TRADD – domena śmierci związana z receptorem TNF (ang. TNFR1-associated death domain)

TRAK – białko wiążące kinezynę układu transportu komórkowego (ang. trafficking kinesin-binding protein)

TRE3 – czynnik transkrypcyjny E3 (ang. transcription factor E3)

TRF – czynnik regulujący teromerazę (ang. telomeraze regulating factor)

TRIM16 – ang. tripartite motif-containing protein 16

tRNA – transportujący kwas rybonukleinowy

TRPML – ang. transient receptor potential mucolipin

TS – system kanalików poprzecznych (ang. transverse system)

TSG – gen podatności na nowotworzenie (ang. tumor susceptibility gene)

γ-TuRC – kompleks startowy pierścienia gamma tubulinowego (ang. γ-tubulin ring complex)

UBAP – białko związane z ubikwityną (ang. ubiquitin-associated protein)

UCP – białka rozprzęgające (ang. uncoupling proteins)

ULF – jednostka długości filamentu pośredniego (protofibryl; ang. unit-length filament)

ULK1/2 – ang. unc-51 like autophagy activating kinase 1/2

UPR – system odpowiedzi na błędnie uformowane białka (ang. unfolded protein response)

UQ – ubichinon

USP30 – hydrolaza C-końca ubikwityny (ang. ubiquitin carboxy-terminal hydrolase 30)

UV – światło ultrafioletowe (ang. ultraviolet)

VAMP – białka związane z błoną pęcherzyków (ang. vesicle-associated membrane proteins)

VAP – białko towarzyszące VAMP (ang. VAMP-associated protein)

VASP – fosfoproteina stymulowana wazodylatatorami (ang. vasodilator-stimulated phosphoprotein)

V-ATPase – pęcherzykowa ATPaza protonowa (ang. vacuolar H⁺-ATPase)

VIP – integralne błonowe białko pęcherzyka (ang. vesicular integral membrane protein)

VPS – białko związane z sortowaniem białek wakuol (ang. vacuolar protein sorting-associated protein)

WASP – białko syndromu Wiskotta-Aldricha (ang. Wiskott-Aldrich syndrome protein)

WET-SEM – „wilgotna” skaningowa mikroskopia elektronowa (ang. wet scanning electron microscopy)

WIPI – białko oddziałujące domeną WP z fosfoinozytolem (ang. WP-repeat domain phosphoinositide interacting protein)

XBP1 – białko 1 wiążące sekwencje X-box (ang. X-box binding protein 1)

XIAP – inhibitor apoptozy powiązany z chromosomem X (ang. X-linked inhibitor of apoptosis)

ZnT – transporter cynkowy (ang. Zn transporter)

Wstęp

Dzisiejsza, bardzo rozległa wiedza na temat struktury i funkcji komórki jest wspólnym dziełem biochemików, genetyków, fizjologów i biologów molekularnych. Nie bez znaczenia są wyniki badań otrzymane we współpracy biologów z fizykami, chemikami oraz badaczami nauk materiałowych. Dlatego biologia komórki zamyka w jedną „komórkową całość” wszystkie dotychczasowe wyniki doświadczeń oraz ich interpretacje pochodzące z prac interdyscyplinarnych.

Książka Strukturalne podstawy biologii komórki jest przeznaczona przede wszystkim dla studentów biologii, co nie oznacza, że nie mogą z niej korzystać studenci medycyny, weterynarii czy chemii. Mamy nadzieję, że książka będzie też źródłem informacji dla nauczycieli biologii w szkołach średnich oraz młodych nauczycieli akademickich, którzy prowadzą zajęcia dydaktyczne z biologii komórkowej.

Celem autorów było opisanie biologii komórek możliwie różnych typów, ze zwróceniem szczególnej uwagi na powiązania strukturalnej organizacji ich cytoplazmy i jądra komórkowego z procesami biegnącymi w obu przestrzeniach.

Książkę otwierają podstawowe informacje na temat technik badawczych, którymi posługuje się współczesny biolog komórki. Obszerniej opisane zostały techniki mikroskopowe, gdyż dzięki nim wiele strukturalnych elementów cytoplazmy i jądra mogło być zaobserwowanych i opisanych, statycznie i dynamicznie. Dalej znajdują się wiadomości uwypuklające różnice między komórkami prokariotycznymi i eukariotycznymi, na poziomie strukturalnym i funkcjonalnym. Tym samym Czytelnikowi będzie łatwiej przyswajać kolejne wiadomości zawarte w dalszej części książki, gdzie omawiana jest organizacja i czynności poszczególnych przedziałów cytoplazmatycznych – organelli, uwzględniając molekularne podłoże przebiegających tam procesów chemicznych.

Tekst książki oparty jest na literaturze źródłowej, która w głównej mierze jest mniej lub bardziej szczegółowym przeglądem ostatnich osiągnięć w strukturze i funkcji komórki. Czytelnik zainteresowany przedmiotem może sięgnąć do pozycji, które zostały umieszczone na końcu każdego rozdziału książki, choć wiele z nich jest literaturą anglojęzyczną.

Ważnym elementem książki są ilustracje, a szczególnie mikrofotografie elektronowe, obrazujące z dużą dokładnością topografię powierzchni komórek oraz ultrastrukturę ich wnętrza. Obszerny wybór kilkuset elektronogramów obejmuje niemal kompletny zestaw organelli komórkowych zwierzęcych, głównie kręgowców i najważniejsze struktury cytoplazmatyczne komórek roślinnych. Zdjęcia z mikroskopu świetlnego ilustrują charakterystyczne, ale podstawowe typy komórek oraz ich sposób organizowania się w tkanki. Zestaw fotografii i elektronogramów powinien przybliżyć Czytelnikowi opisywane w książce struktury oraz zapewnić dobrą orientację w złożonej i zróżnicowanej organizacji komórki. Temu samemu celowi mają służyć dość drobiazgowe i obszerne objaśnienia do mikrofotografii. Niestety, niektóre fotografie mikroskopowe i elektronogramy nie są opatrzone skalą, aby Czytelnik miał sposobność poznania rozmiarów niektórych struktur komórkowych. Nie jest to nasze celowe działanie. Wiele z nich, szczególnie elektronogramy, ma wartość historyczną. Powstały one we wczesnych latach 70. ubiegłego stulecia i ich skalowanie jest po prostu niemożliwe.

Schematy i ryciny ilustrujące tekst książki dzielą się na dwie grupy. Pierwsza grupa prezentuje niektóre struktury cytoplazmatyczne, np. rzęski lub wici, których schematyczne przedstawienie powstało dzięki rekonstrukcji wielu obrazów mikroskopowych, niejednokrotnie tomograficznych lub w formie seryjnych przekrojów. Owe obrazy dwuwymiarowe zostały zamieszczone na elektronogramach. Do drugiej grupy należą ryciny i schematy przebiegu procesów metabolicznych, jak np. oksydatywnej fosforylacji lub niecyklicznego transportu elektronów w czasie fotosyntezy. Schematy metaboliczne zostały przedstawione w dużym uproszczeniu, jednak z zachowaniem istotnych elementów ilustrowanego procesu.

Niemal wszystkie fotografie wykorzystane w książce pochodzą ze zbiorów profesora Wincentego Kilarskiego. Jedynie kilka zostało zamieszczonych za zgodą innych autorów i wydawców. Osobom tym, których nazwiska wymieniono w tekście objaśniającym fotografie, składamy tą drogą serdeczne podziękowanie. Miłym obowiązkiem autorów jest również wymienienie nazwisk osób współpracujących: z Zakładu Biologii i Obrazowania Komórki, Instytutu Zoologii i Badań Biomedycznych, Wydziału Biologii Uniwersytetu Jagiellońskiego. Dzięki ich życzliwości i oddaniu w wyborze materiału fotograficznego ilustracje mogły powstać i być zamieszczone w książce. Do grona tych osób należą: mgr Jadwiga Faber, mgr Władysława Jankowska, mgr Maria Kozłowska, mgr Ewa Krzysztofowicz, mgr Bernadetta Bilska, dr Danuta Semik i dr Olga Woźnicka. Podziękowania należą się również studentom kierunku biologia Wydziału Biologii Uniwersytetu Jagiellońskiego, którzy w ramach kursu „Mikroskopia optyczna i obrazowanie w biologii” przygotowali preparaty mikroskopowe i uwiecznili cyfrowo wiele obrazów tkanek kręgowców. Wszelkie niedostatki tekstu obciążają wyłącznie autorów.

Teoria komórkowa – wprowadzenie

Teoria komórkowa, obok teorii ewolucji i teorii dziedziczenia, jest jednym z najszerszych i najbardziej podstawowych uogólnień biologicznych. We współczesnym ujęciu głosi ona, że wszystkie organizmy żywe – rośliny, zwierzęta i bakterie są zbudowane z komórek, które są ich podstawowymi jednostkami strukturalnymi i fizjologicznymi. Wkrótce po przyjęciu teorii komórkowej została ona uzupełniona założeniem, że nowe komórki powstają przez podział już istniejących. Twierdzenie, że komórki powstają z już istniejących komórek przez ich podział i że dziedziczą po nich swoje cechy, leży u podstaw całej biologii, ale wywołuje pytanie o przeszłość komórek, a co za tym idzie – o pochodzenie życia na Ziemi. W XIX wieku twierdzenie to stawiało raz na zawsze tamę dysputom na temat „samorództwa” organizmów, tak modnym w owym okresie. Ponieważ podstawowe funkcje wszystkich żywych komórek opierają się na podobnych procesach chemicznych, należy założyć, że wszystkie żyjące komórki powstały na drodze ewolucji w ściśle określonych warunkach z prakomórek, które w sposób bardzo podobny rozwiązywały podstawowe procesy życiowe.

Podstawę do takiego sposobu rozumowania daje opublikowana w roku 1859 przez Karola Darwina teoria ewolucji, która stała się kluczem do zrozumienia historii rozwoju organizmów. Podstawowe cechy organizmów, takie jak zmienność, dziedziczność oraz mechanizmy działania doboru naturalnego, doprowadziły do powstania ogromnej różnorodności biologicznej naszej biosfery. Wszystkie te procesy można wytłumaczyć, posługując się teorią komórkową w połączeniu z teorią ewolucji i dziedziczności. Pozwala to na zrozumienie unikalnego zjawiska przyrodniczego naszej planety, jakim jest życie – od jego powstania do dnia dzisiejszego.

Za pierwszych fundatorów teorii komórkowej uważa się Teodora Schwanna, zoologa z Jeny, i Mateusza Schleidena, botanika z Wiednia. Jakkolwiek nie byli oni pierwszymi, którzy postulowali komórkową budowę organizmów żywych, to sformułowali swój pogląd tak przekonująco i wyraziście, że ich teoria została powszechnie przyjęta przez współczesnych im biologów. Wiarygodność ich postulatu była oparta na wnikliwych obserwacjach różnych tkanek roślinnych i zwierzęcych pod mikroskopem oraz na opublikowanym w roku 1839 przez Schwanna dziele pt.: Mikroskopische Untersuchungen über die Uebereinstimmung in der Struktur und dem Wachstum der Tiere und Pflanzen.

Ufundowanie teorii komórkowej było kamieniem milowym na drodze rozwoju nauk biologicznych w XIX stuleciu. O ile pierwotny zarys teorii był pełen błędów oraz fantazji i mógł budzić wiele zastrzeżeń, o tyle samo jej ogłoszenie było punktem zwrotnym w interpretowaniu zjawisk biologicznych. Uznając cytoplazmatyczny twór otoczony błoną za podstawową jednostkę organizacyjną i fizjologiczną życia, teoria komórkowa stała się jedną z najważniejszych unifikacyjnych teorii biologicznych równą swym ciężarem interpretacyjnym ogłoszonej 20 lat później teorii ewolucji.

Teoria komórkowa wywołała przełom nie tylko w badaniach anatomicznych, lecz także fizjologicznych. Zakładając zgodnie z teorią, że komórka tworzy spójnię strukturalno-fizjologiczną, poszukiwano wyjaśnienia, które tłumaczyłoby aktywność życiową poszczególnych komórek w przełożeniu na aktywność całego organizmu. Na uwagę zasługują dwa poglądy wyjaśniające tę zależność:

1. Milne Edwards, zoolog i fizjolog francuski XIX wieku, twierdził: „harmonia wszystkich części organizmu zależy nie od wzajemnego na siebie wpływu jego cząsteczek składowych (w domyśle komórek), lecz jest wynikiem koordynacji uwarunkowanej wolą jednolitej zasady, z góry założonego planu, poprzedzającej idei”. Pogląd ten miał w XIX wieku zdecydowanie znamiona idealistyczne, jakkolwiek nie był on całkowicie pozbawiony podstaw, ale jedynie wtedy, gdy usunęło się z niego takie pojęcia jak: „wola” oraz „idea”, a obserwowaną „harmonię” wytłumaczyło nieprzerwaną, przez miliony lat trwającą selekcją optymalnych rozwiązań morfo-fizjologicznych, kontrolowanych przez dobór naturalny. Po wykonaniu tej poprawki edycyjnej pogląd Edwardsa staje się bardziej przystający do drugiego poglądu reprezentowanego przez Rudolfa Virchowa w roku 1858, a nawet go rozszerza.

2. Rudolf Virchow uważał organizm za sumę lub rodzaj „państwa komórek”, z których każda jest samodzielnym jestestwem. Z jego założenia wynikało niezbicie, że funkcje całego organizmu są niejako sumą arytmetyczną funkcji wszystkich budujących go komórek. Pogląd Virchowa można uważać za skrajnie mechanistyczny, ale z upływem czasu został on rozszerzony i uzupełniony przez tegoż samego Edwardsa, a następnie Ernsta Haeckela, i stał się podstawą do organizmalnego pojmowania zjawisk życiowych, przeciwstawiając się poglądowi witalistycznemu na funkcjonowanie organizmów. Był to poważny krok w budowaniu aparatu myślowego, który pozwalał w sposób właściwy i jednoznaczny tłumaczyć wiele zjawisk biologicznych w zakresie morfologii, fizjologii i patologii organizmów.

Podstawowym wyzwaniem w XIX wieku dla nowo powstałej dyscypliny nauki – cytologii, było pytanie o genezę i pochodzenie nowych komórek; poszukiwanie mechanizmów pozwalających na zachowanie (dziedziczenie) jej cech indywidualnych i ewolucji w złożony organizm wielokomórkowy. Wielu poprzedników Schleidena i Schwanna, głównie botaników tej miary co Adolphe Brogniart (1827), Franz Meyen (1830), Charles-François Brisseau de Mirbel (1835) i Hugo von Mohl (1835), obserwowało powstawanie nowych komórek na drodze podziału już istniejących. Jakkolwiek zarówno Schleiden, jak i Schwann uwzględnili te obserwacje w swoich opracowaniach, to ich zdaniem nie dawały one pełnej odpowiedzi na podstawowe pytanie. Uzupełniając swoją teorię komórkową, wysunęli własną koncepcję, której główną ideą było powstawanie komórek de novo. Nowe komórki miały formować się na drodze materializacji jakiejś nieokreślonej macierzy, którą nazwali cytoblastemą, obecną w komórkach „rodzicielskich”.

Hipoteza cytoblastemy, która miała wytłumaczyć pochodzenie komórek, a jednocześnie przeciwstawić się stale penetrującej nauki biologiczne teorii „samorództwa”, wzbudziła wiele zastrzeżeń, gdyż sama w sobie zawierała elementy „samorództwa”. W latach 1840–1860 wielu badaczy zwróciło na ten problem szczególną uwagę, zwłaszcza że ich wielostronne obserwacje nie potwierdzały teorii blastemy. Ze znanych botaników XIX stulecia, przeciwników teorii blastemy, należy wymienić takie nazwiska jak: Franz Unger, Hugo von Mohl i Carl Nägeli, ze strony zaś zoologów były to autorytety tej miary, co Albert von Kölliker, Robert Remak i Rudolf Virchow.

Po dwudziestoletnich badaniach odrzucono w końcu hipotezę powstawania komórek de novo, nie naruszając przy tym trzonu samej teorii komórkowej. Wysunięto propozycję, że komórki mogą powstawać jedynie z już istniejących komórek. Pogląd ten zaprezentował po raz pierwszy w roku 1844 von Kölliker, w swojej klasycznej pracy nad rozwojem głowonogów, a następnie uogólnił swój pogląd, rozszerzając go na świat roślin. Niestety nie można było przedstawić eksperymentalnego dowodu na to, że komórki nie powstają de novo czy też, że powstają wyłącznie przez podział. Konieczne było zatem posłużenie się dogmatem, że omnis cellula e cellula (wszystkie komórki pochodzą tylko od komórki).

Powszechnie za fundatora owego bezkrytycznego stwierdzenia, uznanego przez współczesnych za rodzaj kanonu wiary, jest uważany Virchov; w roku 1855, równocześnie z Remakiem propagowali swoje credo, które stało się niezastąpionym dogmatem we wszystkich laboratoriach świata. Jak to zwykle bywa w naukach przyrodniczych, dogmatyczne stwierdzenia nie są przez wszystkich akceptowane; i tak było również ze słynnym dogmatem Virchowa. Pod koniec XIX i w początkach XX wieku słyszało się jeszcze tu i tam echa teorii blastemy i supozycje, że komórki mogą powstawać de novo. Jednak jak pisze Edmund B. Wilson w swojej książce pt.: Cell in heredity and development wydanej w 1896 roku, były one zazwyczaj efektem błędnych interpretacji oraz niezrozumienia postulatu Virchowa.

Aforyzm Virchowa, co zresztą podkreślał sam autor, odnosił się tylko do „chwili obecnej”, tzn. do współczesnych warunków geofizycznych panujących na Ziemi. Myślą przewodnią twórcy było, że życie w obecnych warunkach nie może powstać spontanicznie (de novo) i jest swojego rodzaju continuum nigdy niekończącego się strumienia dzielącej się protoplazmy uformowanej w postać komórki, która jako individuum rodzi się i umiera, a życie płynie zawsze w jednym kierunku.

Aby zrozumieć, dlaczego dzisiejsze komórki, a zatem i organizmy, są takie, jakie są, musimy zrozumieć ich historię, cofając się 3 miliardy lat do mglistych początków pojawienia się pierwszych komórek na naszej planecie. Obecnie dysponujemy bardzo dobrymi dowodami, że życie mogło powstać spontanicznie z materii nieorganicznej we wczesnym okresie „życia” planety.

Prekursorzy teorii komórkowej. Podobnie jak to się dzieje w innych dziedzinach wiedzy, teoria komórkowa nie pojawiła się jako nagły przebłysk geniuszu jednostki, ale była konsekwencją wielosetletnich obserwacji i teoretycznych przemyśleń nad budową żywej materii. Myśl, że wszystkie rośliny i zwierzęta zbudowane są z podobnych do siebie cząstek, jest poglądem bardzo starym. Wielcy prekursorzy nauk przyrodniczych, Arystoteles, już na 350 lat przed naszą erą, i Claudius Galenus (Galen), w drugim stuleciu naszej ery, postulowali, że wszystkie rośliny i zwierzęta, mimo ich zasadniczej odmienności, są zbudowane z niewielkiej liczby typów cząstek wielokrotnie się powtarzających. Należy podziwiać intuicję tych obserwatorów i wnikliwość rozumowania; obaj uczeni nie dysponowali bowiem żadnymi instrumentami, przy pomocy których mogli potwierdzić swoją hipotezę.

Punktem zwrotnym w badaniach nad strukturą materii żywej stało się skonstruowanie pod koniec XVI wieku przez braci Janssenów prostego mikroskopu, który w początkach swojej kariery powiększał zaledwie 5 razy i był uważany przez François-Marie Voltaire’a i Karola Linneusza za zabawkę snobów. Dopiero w drugiej połowie XVII wieku znakomity obserwator Robert Hooke wskazał właściwą drogę dla zastosowania tego instrumentu, ale ulepszonego już przez Francisca Fontanę w roku 1646 i osiągającego powiększenie 30-krotne. Hooke opisał w roku 1665 budowę cienkiego skrawka korka, a powtarzające się elementy jego struktury nazwał komórkami (cellulae). Termin „komórka” nie był w pełni trafnym określeniem, gdyż znamionował „pustą przestrzeń ograniczoną ścianami”, niemniej jednak okazał się bardzo wygodnym pojęciem strukturalnym i został powszechnie zaakceptowany, wchodząc na stałe, początkowo do nomenklatury botanicznej, a później zoologicznej. Tym samym Hooke, bezwiednie, zapoczątkował nową dyscyplinę biologiczną – cytologię. Od dwóch stuleci robi ona zawrotną karierę i jest podstawową dyscypliną naukową, na której opierają się wszystkie inne dyscypliny nauk biologicznych. Obecnie cytologia została zastąpiona terminem biologia komórkowa.

Od wspomnianego wyżej, pamiętnego okresu pojawiają się, początkowo sporadycznie, a później coraz to liczniej, opisy roślin i zwierząt przy pomocy nowego dla naturalistów instrumentu – mikroskopu. Należy do nich zaliczyć Konrada Gesnera, który w roku 1558 opisał otwornice (Foraminifera), Galileo Galileiego (Galileusza) opisującego w roku 1610 oczy owadów, Marcella Malpighiego, który w roku 1675 stwierdził, że utriculae budują tkanki roślin, z kolei Nehemiah Grew w roku 1670 opisuje już komórkową budowę roślin. Należy zaznaczyć, że w pierwszym okresie „panowania mikroskopu” dostęp do tego instrumentu był ograniczony, a to ze względu na jego cenę. W większości przypadków mikroskop był w posiadaniu ludzi zamożnych i służył jako element dekoracyjny, nieprzynoszący żadnego nauce pożytku. Dopiero Antoni van Leeuwenhoek (1632–1723) skonstruował mikroskop powiększający 270-krotnie i przy jego pomocy opisał rozmaite animacula, między innymi krwinki czerwone i plemniki oraz włókna mięśni poprzecznie prążkowanych, z dokładnością nieustępującą późniejszym opisom wykonanym w wiekach XIX i XX.

Przez następne 200 lat od ukucia przez Hooke’a terminu „komórka”, botanicy i zoologowie posługiwali się tym określeniem lub jego synonimami; co więcej, dopuszczali w swoich rozważaniach komórkową organizację opisywanych organizmów, tym samym, może nieświadomie, budując podwaliny pod koncepcję komórkowej organizacji materii żywej. W poczet XVIII-wiecznych prekursorów tej koncepcji należy zaliczyć oczywiście van Leeuwenhoeka, który nie był świadom doniosłości swoich obserwacji, podobnie jak współcześni mu członkowie Królewskiego Towarzystwa Naukowego w Londynie, którym van Leeuwenhoek przysłał około 200 sprawozdań. W 100 lat później Kasper Wolff w dziele Theoria generationis utożsamiał „pęcherzykową” (komórkową) strukturę roślin z budową zwierząt.

Coraz to więcej obserwacji wskazywało na obecności w tkankach roślin tzw. globul, które były artefaktem optycznym, ale skłoniły francuskiego botanika Henriego J. Dutrocheta do postawienia w roku 1824 prawidłowej tezy, że komórka jest fundamentalną jednostką żywych organizmów. Pod koniec XVIII wieku panowało już wśród naturalistów powszechne mniemanie, a właściwie teoria, że zwierzęta i rośliny są zbudowane z drobnych globuli – komórek. Głównie botanicy przyczynili się do rozpowszechniania tego poglądu, a to dlatego, że komórki roślinne dzięki obecności celulozowej ściany komórkowej były łatwo dostrzegalne nawet przy pomocy stosunkowo prymitywnych mikroskopów. W roku 1831 Robert Brown opisał jądro komórkowe w komórkach storczyków, a niezależnie w tym samym prawie czasie Jan E. Purkinje opisał jądro komórkowe w komórkach tarczy zarodkowej kurczęcia.

W pierwszym dziesięcioleciu XIX wieku ulepszono mikroskop. Wprowadzono soczewki achromatyczne, usunięto szereg wad optycznych, a przede wszystkim zjawisko aberracji sferycznej i chromatycznej. O ile mikroskop XVII- i XVIII-wieczny powiększał najwyżej 200-krotnie, o tyle w wieku XIX, po usunięciu większości wad optycznych, można było w przeciętnym mikroskopie powiększać przedmioty 1000-krotnie, a jego rozdzielczość użytkowa (0,25 μm) osiągała połowę długości fali światła białego (0,55 μm). Dzięki doskonaleniu instrumentu optycznego i rozwojowi chemii barwników anilinowych rozwinęła się nasza wiedza o komórce.

W następnych latach XIX i początkach XX stulecia cytologowie „zaludniają” pustą początkowo komórkę mnogimi strukturami cytoplazmatycznymi, z których wiele okazało się artefaktami powstałymi w procesie utrwalania i barwienia komórek, a które w latach nam już współczesnych zweryfikował mikroskop kontrastowo-fazowy i mikroskop elektronowy.

Unifikacyjny charakter teorii komórkowej. Na czym polega unifikacyjny charakter teorii komórkowej? Zasada, że komórki powstają tylko z już egzystujących komórek i że dziedziczą po nich swoje cechy, leży u podstaw całej biologii, a w szczególności dyscypliny naukowej genetyki. Dogmat Virchowa, omnis cellula e cellula, zdecydowanie związał badania nad komórką z badaniami nad dziedzicznością i ewolucją, gdyż dziedziczność ujawnia się jako konsekwencja ciągłości genetycznej komórek dzięki ich podziałom. Fizyczną ciągłość elementów odpowiedzialnych za ten proces odkrył Eduard van Beneden w latach 1883, 1884 i 1887. Wskazał on w pracy nad rozwojem glisty końskiej (Ascaris megalocephala), że potomstwo otrzymuje po połowie chromosomów od obojga rodziców. Przełom myślowy dokonał się dopiero wtedy, kiedy doniosłość odkrycia van Benedena podchwycił w roku 1888 August F. Weismann, wykazując jego znaczenie dla zrozumienia mechanizmów dziedziczności, a w konsekwencji mechanizmów ewolucji. Tym sposobem teoria komórkowa stanowi organiczną całość z teorią dziedziczenia i ewolucji.

Należy podkreślić, że teoria komórkowa nie spełnia wszystkich wymogów formalnych, jakie stawia się teoriom i nie jest teorią w całym tego słowa znaczeniu, lecz jedynie teorią z nazwy. W miarę upływu czasu stała się jedynie stwierdzeniem istniejącego faktu, że wszystkie organizmy żywe zbudowane są z komórek, a stwierdzenia faktu nie można nazwać teorią. Ostatnie zdanie nic jednak nie ujmuje z doniosłości i uniwersalności „teorii komórkowej”.

1

Podstawowe techniki badawcze

1.1
Instrumenty optyczne – mikroskopy świetlne, elektronowe i inne

U podstawy konstrukcji mikroskopów świetlnych różnego typu legły dwa zasadnicze zjawiska, którym podlega promień światła. Dotyczy to jego załamania i odbicia na granicy dwóch środowisk o różnych gęstościach optycznych (różnych współczynnikach załamania światła n) oraz dyfrakcji i interferencji światła. W klasycznym mikroskopie optycznym możemy oglądać żywe komórki w hodowli in vitro, drobne organizmy wielokomórkowe, a także preparaty komórkowe lub tkankowe utrwalone i barwione (kontrastowane). Obrazy powstają najczęściej dzięki przechodzeniu (transmisji) światła przez preparat, choć obserwacje w świetle odbitym są również możliwe. W tym celu każdy mikroskop jest wyposażony w dwa główne komponenty: mechaniczny i optyczny. Pierwszy służy do manipulowania preparatem i przesuwania części optycznych względem preparatu. Drugi zaś do oświetlenia preparatu i wytworzenia jego obrazu. Część mechaniczna składa się z ruchomego stolika preparatu umieszczonego pod lub nad obiektywami, odpowiednio w mikroskopie prostym i odwróconym (ryc. 1.1.1). Stolikiem precyzyjnie ustawiamy preparat względem obiektywu, dzięki osiom posuwu X i Y. Do uzyskania ostrego obrazu preparatu służy układ śrub przesuwu zgrubnego i drobnego (mikro- i makrometrycznych) ustawiających preparat w odpowiedniej odległości względem ogniska przedmiotowego obiektywu (oś posuwu Z). Mechaniczne elementy mikroskopu pozwalają też na właściwe skupienie światła na preparacie.

RYC. 1.1.1. Schematy uproszczone mikroskopów: odwróconego (lewy) i prostego (prawy), wraz z przebiegiem wiązek świetlnych. Mikroskop odwrócony służy głównie do obserwacji komórek pozostających w naczyniach do hodowli in vitro (butelkach, szalkach, płytkach wielodołkowych itp.). Mikroskop prosty wykorzystuje się natomiast do rutynowych obserwacji preparatów komórkowych lub tkankowych zamkniętych między szkiełkiem przedmiotowym i nakrywkowym. K – kamera, KO – kondensor, O – obiektyw, OK – okulary, OŚ – oświetlacz, S – stolik.

Część optyczna składa się z obiektywów, okularów, kondensora i elementów oświetlacza (zwierciadeł, soczewek kolektorowych). Obiektywy, w najprostszych mikroskopach, wytwarzają obraz pośredni preparatu, który jest rzeczywisty, odwrócony i powiększony. Okulary zaś działają jak lupa, toteż powiększają pośredni obraz wytworzony przez obiektyw, dając ostatecznie obraz pozorny i prosty (nieodwrócony). Kondensor ogniskuje światło pochodzące z lampy oświetlacza w płaszczyźnie preparatu, zapewniając równomierne oświetlenie pola widzenia. Kluczowe dla właściwego obrazowania preparatów biologicznych jest ustawienie elementów optycznych mikroskopu zgodnie z zasadą Köhlera. Według niej 1) obrazy preparatu i źródła światła nigdy nie powstają w tej samej płaszczyźnie, 2) oświetlenie powinno być jednorodne i dotyczyć wyłącznie pola widzenia okularów oraz 3) apertury numeryczne (NA) obiektywu i kondensora powinny być sobie równe (ryc. 1.1.2A). Dzięki temu otrzymuje się obrazy o optymalnej jasności i kontraście oraz rozdzielczości przestrzennej.

RYC. 1.1.2. Rozmieszczenie części optycznych i przysłon mikroskopu świetlnego zgodnie z zasadą oświetlenia preparatu wg Köhlera (A). Obraz źródła światła (Ż), dzięki obecności soczewki kolektora oświetlacza (SK), pojawia się w płaszczyźnie przysłony aperturowej (PA) kondensora (KO) oraz w źrenicy wyjściowej obiektywu. Obraz przysłony polowej oświetlacza (PP) powstaje dokładnie w płaszczyźnie preparatu (P), a wspólnie, obrazy obu przedmiotów, tworzone są za obiektywem (O) jako obraz pośredni (OP). Zgodnie z zasadą oświetlenia wg Köhlera kąty aperturowe obiektywu (αo) i kondensora (αk) powinny być sobie równe (B), toteż obecność przysłony aperturowej pod kondensorem jest kluczowa dla właściwego dostosowania αk do zmiennych wartości αo.

Powiększenie i zdolność rozdzielcza. Zadaniem mikroskopu jest powiększanie obiektów, które są niewidoczne dla oka obserwatora. Toteż powiększenie jest jednym z czynników decydujących o możliwościach badawczych instrumentu, ale nie najważniejszym. Powiększenie całkowite mikroskopu jest iloczynem powiększenia okularu i obiektywu. W nowoczesnych mikroskopach należy jeszcze uwzględnić powiększenie pryzmatu kierującego światło z obiektywów do okularów (powiększenie nasadki okularowej, tubusu). Wartości powiększeń dla tych elementów są umieszczone na obudowach odpowiadających im części optycznych. W przypadku kamer montowanych na tubusach łączących je z głowicą mikroskopu (nasadką okularową) należy wziąć pod uwagę wartość powiększenia i tego elementu. Należy zaznaczyć, że tubus kamery mikroskopowej niekoniecznie będzie powiększał obrazy. Bardzo często, dla zwiększenia jasności obrazów lub pola widzenia przedmiotu, tubus zawiera pomniejszający element optyczny.

Zdolność rozdzielcza mikroskopu w płaszczyźnie X-Y (ρX) zależy od długości fali światła (λ) oświetlającego preparat (jest do niej wprost proporcjonalna) oraz od apertury numerycznej obiektywu (NA), do której jest odwrotnie proporcjonalna. W osi Z natomiast ρZ jest odwrotnie proporcjonalna do kwadratu NA, toteż zdolność rozdzielcza jest około 2–3 razy mniejsza w osi Z w porównaniu z osią X-Y:

Aperturę numeryczną definiuje się jako iloczyn współczynnika załamania światła (n) środowiska pracy obiektywu i sinusa kąta aperturowego (α) (ryc. 1.1.2B).

NA = n · sinα

Wartość apertury numerycznej obiektywu jest umieszczona na jego obudowie i wynosi w zależności od powiększenia obiektywu od 0,07 (np. dla obiektywu powiększającego 2,5×) do 1,40 (np. dla obiektywu 100×). Przeciętna zdolność rozdzielcza mikroskopu przy oświetleniu preparatu światłem białym (λ = 0,5 μm) i dla obiektywu o NA 1,40 wynosi około 0,22 μm. Oznacza to, że dwa obiekty leżące obok siebie w odległości 0,22 μm można jeszcze dostrzec jako oddzielne. W przypadku mniejszej zdolności rozdzielczej obiekty te zostaną dostrzeżone jako jeden; nie zostaną rozdzielone (ryc. 1.1.3). Dla celów praktycznych można przyjąć, że zdolność rozdzielcza mikroskopu świetlnego ma mniej więcej wartość połowy długości fali światła i_008 , którym oświetlamy preparat. Warto zaznaczyć, że NA jest również właściwa dla kondensorów mikroskopowych i jej wartość powinna być wygrawerowana na obudowie kondensorowego układu optycznego.

RYC. 1.1.3. Uproszczone przedstawienie zależności zdolności rozdzielczej obiektywu od wartości jego apertury numerycznej (NA), przy założeniu oświetlania obiektów tą samą długością fali. Jeśli NA obiektywu wynosi 0,24, to dwa obiekty bardzo blisko siebie leżące jawią się jako pojedynczy przedmiot. Tymczasem już dla wartości NA 0,4 można przypuszczać o obecności dwóch obiektów w polu widzenia mikroskopu. Problem ten rozwiązuje obiektyw o NA 0,65, gdzie widoczne są dwa przedmioty, a bez wątpienia są one rozdzielone za pomocą obiektywu o NA 1,2. Dla ułatwienia powiększenie obiektywów zostało pominięte.

Mikroskop kontrastowo-fazowy jest modyfikacją optyczną mikroskopu świetlnego pozwalającą zobrazować przedmioty niebarwione (niekontrastowe). W przyrodzie spotykamy się z przedmiotami amplitudowymi, które w różnym stopniu pochłaniają światło – zmieniają amplitudę przechodzącego lub odbitego światła, a zatem posiadają kontrast naturalny. Większość przedmiotów biologicznych jest jednak przedmiotami fazowymi, które nie pochłaniają światła w sposób dostrzegalny, a jedynie zmieniają jego fazę (φ). Przedmioty fazowe mają więc różny od środowiska współczynnik załamania światła (n), a stopień zmiany fazy fali świetlnej zależy nie tylko od gęstości optycznej przedmiotu, lecz także od jego grubości. Przedmioty amplitudowe posiadają zatem kontrast naturalny, podczas gdy przedmioty fazowe nie. Podział na przedmioty amplitudowe i fazowe jest całkowicie arbitralny, gdyż nie ma wyraźnej granicy między nimi. Zarówno przedmioty amplitudowe mogą wywoływać mniejsze lub większe przesunięcie fazy fali świetlnej, jak i przedmioty fazowe mogą w pewnym stopniu zmieniać amplitudę fali świetlnej – pochłaniać światło. Żywe komórki i tkanki uznaje się w zasadzie za przedmioty fazowe, a jedynie niektóre tylko komórki i tkanki należą do grupy przedmiotów mieszanych (amplitudowo-fazowych).

Mikroskop kontrastowo-fazowy posiada dwa dodatkowe elementy, które skutecznie pogłębiają niewidoczne dla oka przesunięcie fazy fali świetlnej. Obiektywy wyposażone są w płytki fazowe, a kondensor w komplementarne płytkom fazowym przysłony pierścieniowe (ryc. 1.1.4A). Prawidłowe ustawienie optyki mikroskopu (wg zasady Köhlera) sprawia, że obraz przysłony pierścieniowej kondensora formowany jest dokładnie w płaszczyźnie płytki fazowej obiektywu. Zatem światło bezpośrednie pochodzące ze źródła może być przez płytkę fazową odpowiednio modyfikowane – pochłaniane, bądź odbijane oraz przesuwane w fazie względem promienia świetlnego przechodzącego przez preparat, zwykle o ± i_010 . W wyniku interferencji zmodyfikowanego w ten sposób światła bezpośredniego ze światłem, które uległo przesunięciu w fazie na strukturach preparatu, powstaje obraz kontrastowy przedmiotu fazowego (ryc. 1.1.5A). Mikroskop kontrastowo-fazowy jest doskonałym narzędziem do obserwacji komórek w hodowlach in vitro, gdzie nie tylko komórki, lecz także ich struktury cytoplazmatyczne są doskonale widoczne. Trzeba jednak zwrócić uwagę, że obrazy przedmiotów są zwykle obarczone jasną obwódką, tzw. halo, które może utrudniać dokładną identyfikację granic przedmiotów.

RYC. 1.1.4. Schematyczny układ elementów mikroskopu kontrastowo-fazowego (A) i mikroskopu z kontrastem interferencyjnym wg Nomarskiego (B). Dodatkowymi elementami w mikroskopie kontrastowo-fazowym są komplementarne optycznie: przysłona pierścieniowa kondensora (PPK) i płytka fazowa (PF). W mikroskopie interferencyjnym kondensor zawiera dodatkowo polaryzator (PO) i pryzmat dwójłomny (PD) (tzw. kompensator), natomiast w przestrzeni głowicy mikroskopu zamontowany jest kolejny pryzmat dwójłomny (PD) i analizator (AN). KO – kondensor, O – obiektyw, OP – płaszczyzna obrazu pośredniego, P – preparat, PP – przysłona polowa, SK – soczewka kolektora oświetlacza, Ż – żarówka oświetlacza.

RYC. 1.1.5. (A) Mikrofotografia unieśmiertelnionych komórek linii ASC52Telo wykonana w mikroskopie kontrastowo-fazowym. Doskonale widoczne jądra komórkowe wraz z jąderkami oraz wypustki cytoplazmatyczne. Wokół komórek, które przechodzą podział, widoczna jasna otoczka, tzw. efekt „halo”, który towarzyszy kontrastowi fazowemu i utrudnia obserwacje. Skala: 50 μm. (B) Prawidłowe komórki macierzyste izolowane z miazgi zębowej zdrowego zęba ósmego i zarejestrowane w mikroskopie interferencyjnym. Widoczne jądra komórkowe wraz z jąderkami oraz wypustki komórek, jednak komórki i ich struktury wydają się reliefem wykonanym na szkle. Efekt jest szczególnie widoczny dla dwóch komórek powstałych po podziale. Skala: 20 µm.

Mikroskop interferencyjny (wg Nomarskiego) jest, podobnie jak mikroskop kontrastowo-fazowy, optycznie zmodyfikowanym mikroskopem świetlnym. Również wykorzystuje nakładanie się na siebie (interferencję) dwu lub kilku wiązek świetlnych, które różnią się od siebie fazami (φ) fali świetlnej. Jednak aby zwiększyć kontrast przedmiotu względem tła, nie stosuje się w nim płytki fazowej i przysłony pierścieniowej, ale cztery inne elementy. Wiązka światła, zanim dotrze do preparatu, jest polaryzowana liniowo przez umieszczony pod kondensorem polaryzator. Płaszczyzna polaryzacji światła nie jest przypadkowa, ale wynika z płaszczyzny łamiącej kryształu dwójłomnego (pryzmatu Nomarskiego lub Wollastona) umieszczonego przed preparatem (kompensator). Zadaniem kryształu jest rozdział wiązki światła na dwie o odmiennych drogach optycznych, prędkościach oraz płaszczyznach polaryzacji (wiązki zwyczajna i nadzwyczajna). Wiązki docierają do preparatu, gdzie ulegają fazowemu przesunięciu wynikającemu z charakteru przedmiotu. Utworzone i tak zmodyfikowane wiązki mogą ze sobą interferować, dzięki ich ponownemu złożeniu przez kolejny pryzmat dwójłomny znajdujący się za obiektywem. Warunkiem jest, aby ich płaszczyzny polaryzacji były uzgodnione przez obecność w tubusie analizatora (ryc. 1.1.4B).

Obrazy przedmiotów obserwowanych w mikroskopie interferencyjnym dają złudzenie trójwymiarowych (ryc. 1.1.5B). W przypadku obserwacji komórek, podobnie jak w mikroskopie kontrastowo-fazowym, doskonale uwidocznione są struktury wewnątrzkomórkowe. Trzeba jednak pamiętać, że efekt kontrastu powstaje dzięki zmianie współczynnika załamania światła (n) środowiska przedmiotu i obiektów znajdujących się w jego wnętrzu. Zatem nie wszystkie obserwowane obiekty będą konkretnymi strukturami, lecz mogą być jedynie lokalnym nagromadzeniem substancji o odmiennym n. Ilościowe określenie zmian w fazie wiązek świetlnych względem siebie pozwala na zmierzenie wielu parametrów przedmiotu, np.: suchej masy, współczynnika załamania światła (n), grubości, stężenia niektórych substancji itp.

Mikroskop fluorescencyjny. W mikroskopie fluorescencyjnym do oświetlenia oglądanego przedmiotu używa się światła emitowanego przez wysokociśnieniową lampę rtęciową lub lampę ksenonową. Lampa rtęciowa emituje światło bogate w promieniowanie nadfioletowe, niebieskie i zielone, podczas gdy lampa ksenonowa traktowana jest jako źródło intensywnego światła białego, bogate w pasma podczerwone. W mikroskopach fluorescencyjnych preparat oświetlany jest przez obiektyw (oświetlenie EPI) w przeciwieństwie do konwencjonalnych mikroskopów prostych, w których preparat jest oświetlany przez kondensor – prześwietlany (oświetlenie DIA) (ryc. 1.1.6). Oświetlony światłem o krótkiej fali (światło wzbudzające) preparat emituje słabe światło (fluorescencja pierwotna; autofluorescencja) o dłuższej fali.

RYC. 1.1.6. Schemat prostego mikroskopu optycznego z oświetleniem preparatu typu DIA (diaskopowym; lewy) i EPI (episkopowym; prawy). Przy oświetleniu DIA światło pochodzące od lampy halogenowej (lub LED) jest skupiane przez kondensor, przechodzi przez przedmiot i trafia do obiektywu. DIA to klasyczny sposób oświetlania preparatów biologicznych w jasnym polu bądź kontraście fazowym. W oświetleniu EPI obiektyw odgrywa rolę kondensora, skupiając wiązkę światła na preparacie oraz formując obraz przedmiotu za sprawą światła odbitego lub wtórnie przezeń generowanego. System EPI jest typowy dla mikroskopii fluorescencyjnej, a źródło światła to najczęściej lampa rtęciowa lub ksenonowa.

Zwykle do preparatów komórkowych lub tkankowych dostarcza się barwniki – fluorochromy, które silne fluoryzują (fluorescencja wtórna). Dzięki temu kontrast między barwionymi elementami a pozostałą częścią przedmiotu lub tłem jest znacznie większy, co ułatwia obserwacje z dużą zdolnością rozdzielczą. Prócz odmiennego sposobu oświetlenia preparatu, dodatkowymi elementami mikroskopu fluorescencyjnego są filtry, które definiują zakres długości fal światła potrzebnych do wzbudzenia i rejestracji fluorescencji (ryc. 1.1.7). Filtry wzbudzające mają za zadanie wyciąć z szerokiego zakresu fal świetlnych wysyłanych przez lampę rtęciową lub ksenonową tylko te, które potrzebne są do wzbudzenia fluorochromu. Filtry emisyjne zaś umożliwiają transmisję światła emitowanego przez fluorochrom do okularów, przy jednoczesnym blokowaniu pasma użytego do wzbudzania fluorescencji. Nie bez znaczenia dla prawidłowego oświetlenia przedmiotu jest obecność zwierciadeł półprzepuszczalnych (dichroicznych), które umożliwiają przesyłanie światła wzbudzającego do preparatu, a światła emitowanego z preparatu do okularów bądź kamery. Dzięki odpowiedniemu układowi wspomnianych wyżej elementów tło w mikroskopie fluorescencyjnym jest ciemne, a światło pochodzi niemal wyłącznie od struktur uprzednio wyznakowanych fluorochromem (ryc. 1.1.8).

RYC. 1.1.7. (A) Uproszczony schemat przebiegu promieni świetlnych w klasycznym mikroskopie fluorescencyjnym (lewy) i skanującym, laserowym mikroskopie konfokalnym (prawy). Dla eliminacji światła pochodzącego spoza płaszczyzn ogniskowych obiektywu mikroskop konfokalny wyposażony jest dodatkowo w przysłonę o regulowanej średnicy (POT). D – detektor (fotopowielacz), FE – filtr emisyjny, FW – filtr wzbudzający, K – kamera, LAS – laser, LR – lampa rtęciowa, O – obiektyw, P – preparat, POT – przysłona otworkowa (ang. pinhole), SK – system skanujący (np. układ zwierciadeł), ZP – zwierciadło półprzepuszczalne (dichroiczne). (B) W mikroskopie fluorescencyjnym wiązka światła wzbudzającego oświetla całe pole widzenia, toteż pełen obraz przedmiotu powstaje dzięki pojedynczemu, krótkiemu oświetleniu preparatu (lewy). W skanującym, laserowym mikroskopie konfokalnym obiektyw skupia wzbudzające światło lasera w płaszczyźnie ogniskowej (prawy). Pełen obraz przedmiotu może powstać wyłącznie dzięki „omiataniu” (skanowaniu) preparatu wiązką światła w osiach X-Y.

RYC. 1.1.8. Emisja fluorescencji wtórnej przez trzy fluorochromy dostarczone do żywych ludzkich komórek linii hMPC32F w hodowli in vitro. Jądra komórkowe zostały uwidocznione w mikroskopie fluorescencyjnym dzięki związaniu DNA z barwnikiem DAPI (niebieski), aparat endosomowy komórek (zielony) emituje światło w związku z nagromadzeniem w pęcherzykach monodansylkadaweryny, natomiast lizosomy/późne endosomy obserwuje się jako efekt emisji czerwonej fluorescencji w kwaśnym środowisku organelli. Skala: 20 μm.

Mikroskop fluorescencyjny ma szerokie zastosowanie w badaniach elementów komórkowych znakowanych uprzednio w różny sposób. W przypadku jąder komórkowych stosuje się fluorochromy o dużym powinowactwie do DNA (np. jodek propidyny, DAPI), kwaśne środowisko lizosomów znakuje się barwnikami fluoryzującymi intensywnie w pH około 5 (np. oranż akrydyny), podczas gdy mitochondria są zdolne do gromadzenia uprzednio utlenionych lub zredukowanych fluorochromów (np. rezazuryna). Wysoce specyficzne znakowanie struktur komórkowych osiąga się z wykorzystaniem przeciwciał sprzężonych z fluorochromami i skierowanych przeciwko charakterystycznemu dla tejże struktury epitopowi (patrz rozdział 1.3.3. Immunocytochemia, immunohistochemia i immunoznakowanie). Obecnie dostępnych jest komercyjnie wiele fluorochromów syntetyzowanych na bazie cząsteczek fluoresceiny, rodaminy czy zupełnie de novo. Dzięki odkryciu białek fluorescencyjnych (tj. białka zielonej fluorescencji; ang. green fluorescent protein), poznaniu ich sekwencji aminokwasowej oraz struktury cząsteczki powszechne stało się modyfikowanie genetyczne komórek i organizmów, w celu ekspresji białek fluorescencyjnych. W efekcie badacze mogą uwidocznić w mikroskopie fluorescencyjnym interesujące ich struktury komórkowe (ryc. 1.1.8).

Mikroskop konfokalny (współogniskowy) jest obecnie podstawowym narzędziem do obserwacji struktur biologicznych znakowanych uprzednio fluorescencyjnie (ryc. 1.1.9). Pierwsze podstawy do skonstruowania mikroskopu konfokalnego były znane już w latach pięćdziesiątych ubiegłego wieku, ale dopiero rozwój techniki komputerowej pozwolił na zrealizowanie w pełni funkcjonalnego skanującego laserowego mikroskopu konfokalnego (ang. laser scanning confocal microscope; LSCM) w połowie lat osiemdziesiątych. Obraz wytworzony przez mikroskop konfokalny jest pozbawiony elementów pochodzących spoza ogniskowej obiektywu, co znacząco zwiększa kontrast obrazów i dzięki temu zdolność rozdzielczą (ryc. 1.1.7 i ryc. 1.1.10). Odcięcie płaszczyzn pozaogniskowych obiektywu podczas tworzenia obrazów realizowana jest dzięki obecności przysłony w formie otworu (ang. pinhole) dopasowanego średnicą do wielkości obrazu dyfrakcyjnego punktu powstającego w płaszczyźnie obrazowej obiektywu (na przedmiocie). Poza przysłoną znajduje się detektor – fotopowielacz, który odbiera i wzmacnia światło emitowane przez fluoryzujące obiekty (ryc. 1.1.7). Wadą systemu konfokalnego skanującego przedmiot skoncentrowaną wiązką światła wzbudzającego jest czas potrzebny do formowania pełnego obrazu preparatu w osi X-Y, a następnie w osi Z. Znacznie wydajniejszym czasowo układem obrazowania jest mikroskop konfokalny z wirującym dyskiem (ang. spinning disc confocal microscope; SDCM), choć zdolność rozdzielcza tego układu jest nieznacznie gorsza od mikroskopu konfokalnego skanującego. Najczęściej, dwa komplementarne ze sobą, szybko wirujące dyski, mają za zadanie skupiać światło emitowane z przedmiotu (pierwszy dysk) na szeregu przysłon otworkowych kolejnego dysku (dysk Nipkowa). Detektorem światła fluorescencyjnego jest tutaj wysokoczuła kamera CCD (ang. charge-coupled device), EM-CCD (ang. electron multiplying CCD) lub CMOS (ang. complementary metal oxide semiconductor). Dzięki takiej konstrukcji możliwe jest obrazowanie żywych komórek i procesów w nich zachodzących niemal w czasie rzeczywistym, nie tylko w formie obrazów dwu-, ale i trójwymiarowych.

RYC. 1.1.9. Laserowy skanujący mikroskop konfokalny firmy Zeiss (LSM 980) w konfiguracji epi- (A) oraz diaskopowej wraz z inkubatorem do prowadzenia obserwacji przyżyciowych komórek (B) (zdjęcie dzięki uprzejmości Carl Zeiss Polska Sp. z o.o.).

RYC. 1.1.10. Emisja fluorescencji pierwotnej w zakresie zieleni komórek parenchymy kłącza Convallaria sp. Fotografia (A) wykonana została w typowym mikroskopie fluorescencyjnym szerokiego pola (WF) i ten sam fragment tkanki (B) zarejestrowany w laserowym mikroskopie skanującym (konfokalnym; LSCM). W przypadku mikroskopu konfokalnego uwagę zwraca doskonały kontrast między elementami komórkowymi i tłem, który powstaje dzięki odcięciu światła fluorescencyjnego z obszarów pozostających poza płaszczyzną ogniskową obiektywu. Skala: 50 μm.

Źródłem światła w skanującym laserowym mikroskopie konfokalnym jest najczęściej układ kilku laserów generujących światło o określonych długościach fal, które wspólnie pokrywają cały zakres długości fal w paśmie widzialnym (od 400 do 750 nm). Obecnie coraz częściej lasery są wymieniane na diody emitujące światło (ang. light emitting diode; LED). W mikroskopie konfokalnym z wirującym dyskiem oświetlenie przedmiotu jest realizowane podobnie jak w mikroskopie fluorescencyjnym, najczęściej lampą ksenonową.

Cyfrowe obrazy otrzymywane w mikroskopach fluorescencyjnych oraz konfokalnych mogą być dalej filtrowane, aby wyeliminować niepożądane sygnały świetlne, będące efektem niedoskonałości optyki mikroskopu oraz charakteru preparatu. Dzięki temu obrazy są nieco większej rozdzielczości przestrzennej. Proces zwany dekonwolucją opiera się na matematycznym procesowaniu otrzymywanych obrazów, eliminacji tła, przy założeniu właściwych dla mikroskopu parametrów wizualizacji, takich jak długość fali światła wzbudzającego/emitowanego, częstotliwości próbkowania obiektu oraz apertury numerycznej (NA) obiektywu. Optymalnym rozwiązaniem dla poprawnego przeprowadzenia dekonwolucji jest eksperymentalne wyznaczenie funkcji punktowego rozkładu intensywności sygnału fluorescencyjnego (ang. point spread function; PSF) na podstawie obrazów obiektów o rozmiarach poniżej zdolności rozdzielczej mikroskopu (< 200 nm).

Innym sposobem poprawy przestrzennej zdolności rozdzielczej mikroskopii konfokalnej jest poznanie położenia maksimum intensywności wspomnianego PSF przez detektor podzielony na wiele segmentów (32 segmenty w Airyscan firmy Carl Zeiss). Znalezienie takiego miejsca na obrazie dyfrakcyjnym pozwala na wyeliminowanie pozostałych, mniejszych wartości intensywności wokół wspomnianego maksimum i przedstawienie obrazu przedmiotu o rozdzielczości około 1,7× większej niż definiowana wspomnianym wcześniej wzorem dla ρX.

Zwiększenie rozdzielczości, szczególnie osiowej, osiąga się także w oparciu o efekt całkowitego wewnętrznego odbicia na granicy dwóch ośrodków – szkła i wody, jak to ma miejsce w technice mikroskopowej TIRF (ang. total internal reflection fluorescence microscopy). Dzięki oświetlaniu przedmiotu wiązką wzbudzającą pod kątem krytycznym można wymusić fluorescencję wyłącznie tych elementów, które znajdują się w obszarach graniczących z podłożem (szkłem), na którym umieszczony jest obiekt (np. komórka). Mniej więcej do ~100 nm w głąb preparatu, następuje wzbudzanie obecnych w nim fluorochromów i emisja fluorescencji, podczas gdy głębiej położone regiony są całkowicie wygaszone. Jest to doskonały sposób na lokalizację miejsc adhezji komórek do podłoża, położenia białek powierzchniowych i integralnych błon komórkowych i elementów cytoszkieletu komórkowego związanego z regionami podbłonowymi, ze zdolnością rozdzielczą w osi Z poniżej 100 nm.

Inny sposobem wykorzystywanym dla zwiększenia zdolności rozdzielczej w osi Z jest technika oparta na ultramikroskopii, gdzie światło wzbudzające fluorescencję przedmiotów dostarczane jest prostopadle do osi obrazowej obiektywu. Formowane w „kartkę” światło oświetla dokładnie region przedmiotu będący w płaszczyźnie ogniskowej przedmiotowej obiektywu, najczęściej z obu stron. Obraz jest rejestrowany przez kamerę w sposób zbliżony do klasycznej mikroskopii fluorescencyjnej szerokiego pola. Mikroskopia LSFM (ang. light sheet fluorescence microscopy), bo o niej mowa, dedykowana jest głównie obserwacjom dużych obiektów, tj. rozwijającym się zarodkom lub elementom układu nerwowego, które w czasie rzeczywistym lub po odpowiedniej preparatyce mogą być obrazowane w układzie trójwymiarowym.

Mikroskopia fluorescencyjna zdobywała i nadal zdobywa coraz większe zainteresowanie wśród badaczy struktury i funkcji komórki, nie tylko ze względu na możliwość przyżyciowych obserwacji, ale i szczególnie dzięki pokonaniu zdolności rozdzielczej tradycyjnych instrumentów optycznych. Już w latach dziewięćdziesiątych ubiegłego stulecia pojawiają się mikroskopy wykorzystujące efekt interferencji światła fluorescencyjnego pochodzącego z dwóch dróg optycznych – obiektywów o dużych wartościach NA umieszczonych po przeciwnych stronach preparatu. Zabieg ten zwiększał znacząco zdolność rozdzielczą obrazów w osi Z i nieznacznie w osi X-Y (np. mikroskopia 4Pi). Niestety technologia powyższego obrazowania jest ograniczona wyłącznie do pojedynczych warstw komórek, najczęściej w hodowlach in vitro.

Odmienną strategią zwiększenia przestrzennej zdolności rozdzielczej mikroskopów optycznych było modyfikowanie przebiegu procesu fluorescencji, dzięki specjalnej budowie fluorochromów i/lub ich wzbudzaniu nadmiernie intensywnym światłem. W zależności od przestrzennej konfiguracji cząsteczki i sposobu jej wzbudzania fluorochrom „włącza się” i „wyłącza”. Sprawia to, że nie wszystkie fluorochromy są wzbudzone w danej chwili, toteż określenie obszaru emisji światła fluorescencyjnego staje się istotnie dokładniejsze w porównaniu z obszarem wzbudzonym w konwencjonalnym mikroskopie fluorescencyjnym bądź konfokalnym, gdzie niemal wszystkie cząsteczki fluoryzują. Konstrukcje mikroskopowe oparte na powyższych zasadach to między innymi PALM (ang. photo-activated localization microscopy) czy STORM (ang. stochastic optical reconstruction microscopy). Techniki te matematycznie rekonstruują obraz na podstawie różnych w czasie emisji „włączonych-wyłączonych” fluorochromów. STED (ang. stimulated emission depletion microscopy) natomiast wykorzystuje do „wyłączania” fluorochromów dodatkowe, specjalnie uformowane i bardzo intensywne światło lasera. Ogranicza to fluorescencję znaczącej części fluorochromów, zmniejszając tym samym wielkość PSF, który wzbudza cząsteczkę; poprawia to tym samym zdolność rozdzielczą.

Zwiększenie zdolności rozdzielczej może być realizowane również w inny sposób. W mikroskopii SIM (ang. structured illumination microscopy) wykorzystuje się liniowy układ prążków interferencyjnych o maksimach i minimach intensywności, które mają za zadanie „włączać” fluorochromy znajdujące się w preparacie, pozostawiając inne niewzbudzone. Układ ów jest następnie kilkakrotnie obracany w płaszczyźnie przedmiotowej, a powstałe obrazy (efekt moiré) są matematycznie odtwarzane przez oprogramowanie komputerowe, dając jeden obraz o znacznie większej rozdzielczości.

Wysokorozdzielcza mikroskopia optyczna (głównie fluorescencyjna) pozwala na osiąganie przestrzennej zdolności rozdzielczej w osi X-Y < 50 nm, czyli znacząco lepszej niż ta definiowana dyfrakcją światła (~200 nm). Z racji objętości niniejszej książki należy odnieść czytelnika do wielu publikacji przeglądowych traktujących o przedstawionych powyżej i wielu innych sposobach zwiększenia zdolności rozdzielczej mikroskopii optycznej, ich aplikacjach, wadach i zaletach w obserwacjach struktur komórkowych.

Mikroskop elektronowy transmisyjny i skaningowy. Na początku XX wieku dokonano odkrycia, które wykazało, że strumień elektronów emitowany z rozżarzonego drutu wolframowego (katody) może zachowywać się jak fala fotonów. Podobnie jak w mikroskopie świetlnym, elektrony, przechodząc przez preparat, mogą ulegać ugięciu na jego strukturach, a przechodząc przez pole magnetyczne, mogą być ogniskowane bądź rozpraszane. Tak więc dzięki podobnym efektom, jakim ulega światło w preparacie i soczewkach mikroskopu optycznego, strumień elektronów jest zdolny do tworzenia obrazów „przezroczystych” dla nich przedmiotów. Zaletą zastosowania strumienia elektronów do formowania obrazów jest ich krótka fala, którą można redukować, przyspieszając bieg elektronów w próżni. Dzięki tym właściwościom mikroskop elektronowy oferuje badaczowi zdolność rozdzielczą, o której nie śniło się pierwszym konstruktorom mikroskopów świetlnych. Mikroskop elektronowy pracujący przy napięciu przyspieszającym 100 kV rozpędza strumień elektronów do prędkości 164 354 km na sekundę. Przy tak dużej prędkości fala elektronowa ma 0,04 Å (4 ⋅ 10–12 m) długości, a zatem zdolność rozdzielcza jest 67 500 razy lepsza od uzyskanej w mikroskopie świetlnym. W praktyce teoretyczna zdolność rozdzielcza mikroskopu elektronowego nie jest jednak nigdy osiągalna z różnych przyczyn – charakteru wiązki elektronowej, niedoskonałości konstrukcyjnych mikroskopu i właściwości preparatów biologicznych. Praktyczna zdolność rozdzielcza wymagana od średniej klasy mikroskopu elektronowego dla celów badań komórkowych powinna wynosić 1 nm (10–9 m); zapewnia ona uzyskiwanie dużych i czytelnych powiększeń.

Jak pracuje mikroskop elektronowy? Strumień elektronów jest emitowany z katody i przyspieszany różnicą potencjałów między nią i znajdującą się w pobliżu anodą. Zanim trafi do pierwszych elementów optycznych kolumny mikroskopu, strumień formowany jest przez ujemnie naładowaną osłonę katody, tzw. osłonę Wehnelta. Tym sposobem średnica wiązki elektronowej jest minimalna. Potencjał zgromadzony w katodzie może sięgać od kilkuset wolt do kilkuset tysięcy wolt w zależności od typu mikroskopu elektronowego. Emiterem elektronów (katodą) może być włókno wolframowe, kryształ LaB₆ lub CeB₆, albo specjalnie przygotowane, niezwykle cienkie na końcu ostrze wolframowe. W pierwszym i drugim przypadku uwolnienie elektronów z materiału wymaga ich podgrzania (emitery elektronów termiczne), podczas gdy z ostrego zakończenia wolframu można wyłuskać elektrony na drodze efektu polowego (ang. field emission gun; FEG). Wtedy, w pobliżu ostrza wolframowego umieszcza się silnie dodatnio naładowany element – anodę ekstrakcyjną. Z punktu widzenia spójności wiązki elektronowej oraz charakteru odwzorowania obrazów minimalna wielkość źródła elektronowego jest korzystna. To sprawia, że mikroskopy elektronowe z działem o emisji polowej (FEG) są obecnie najczęściej wykorzystywane, jeśli instrument ma służyć do uzyskiwania najwyższych zdolności rozdzielczych.

W mikroskopie elektronowym transmisyjnym (ang. transmission electron microscope; TEM), gdzie ultracienki preparat jest „prześwietlany” przez rozpędzony strumień elektronów, za ich ogniskowanie w płaszczyźnie preparatu odpowiedzialne jest pole magnetyczne generowane przez dwie lub trzy soczewki elektromagnetyczne, kondensorowe. Elektrony ulegają następnie ugięciu i pochłanianiu, odpowiednio na strukturach preparatu i przysłonach, a elektromagnetyczna soczewka obiektywowa wytwarza ich obraz, powiększany następnie przez kolejne układy soczewek, tzw. projekcyjnych. Obraz preparatu zostaje wytworzony na ekranie fluorescencyjnym i ostatecznie rejestrowany przez wysokoczułe kamery CCD, EM-CCD lub CMOS. Optyka elektromagnetyczna mikroskopu elektronowego pracuje w próżni, aby zapewnić swobodny ruch elektronów od źródła przez preparat aż do elementu rejestrującego obraz (ryc. 1.1.11A TEM).

Przedstawiony powyżej bieg elektronów do złudzenia przypomina przebieg światła przez układ optyczny prostego mikroskopu świetlnego. Istotna różnica między mikroskopem świetlnym i elektronowym polega jednak na tym, że w mikroskopie świetlnym obraz powstaje w wyniku absorpcji fotonów światła na elementach amplitudowego preparatu, natomiast w TEM obraz powstaje w wyniku ugięcia bądź absorpcji elektronów na strukturach preparatu. Stopień ugięcia elektronów zależy od masy cząsteczkowej tych struktur (średniej liczby Z pierwiastków je budujących). Im większa średnia wartość Z, tym większa część elektronów zostaje ugięta i nie wchodzi do otworu obiektywu (φ ≈ 20 µm). Zostaje pochłonięta przez jego przysłony i nie rozświetla ekranu fluorescencyjnego, tak jak czynią to elektrony nieugięte na strukturach preparatu. Powstały obraz jest zatem mozaiką obszarów o różnych stopniach natężenia fluorescencji ekranu, co przekłada się na odmienne skale szarości w obrazie cyfrowym kamery. Uzyskane obrazy nie są kolorowe! (ryc. 1.1.11B).

RYC. 1.1.11. (A) Schematyczne przedstawienie układu optycznego mikroskopu elektronowego transmisyjnego (TEM) i skaningowego (SEM). Elektrony emitowane są przez działo elektronowe (DE) i rozpędzane dzięki różnicy potencjałów między katodą (KAT) i anodą (A). Otrzymana wiązka elektronów jest koncentrowana w transmisyjnym mikroskopie elektronowym (TEM) na preparacie (S) przez układ kondensorowy (K), natomiast w mikroskopie skaningowym (SEM) trafia do obiektywu (O) i dopiero w formie niewielkiego punktu na powierzchnię preparatu (S). (B) Elektronogram TEM fragmentu komórki wątroby szczura. Widoczne jądro komórkowe (J) i jego struktura oraz poszczególne elementy cytoplazmy, np.: mitochondria (Mit), siateczka śródplazmatyczna ziarnista (SZ) i gładka (SG), peroksysomy (P) oraz krople tłuszczu (T). Powiększenie: 2400×. (C) Topograficzny obraz powierzchni nabłonka z pęczkami rzęsek, pokrywającego tchawicę szczura, uzyskany dzięki detekcji elektronów wtórnych. Skala: 5 μm.

Zasada działania mikroskopu elektronowego skaningowego (ang. scanning electron microscope; SEM) różni się od opisanego wyżej TEM w kilku punktach. Podstawowe rozwiązania dotyczące emisji elektronów i ogniskowania ich strumienia są w zasadzie podobne. Różnice polegają na innym sposobie tworzenia obrazu preparatu. W SEM wiązka elektronowa uformowana przez soczewki kondensorowe nie pada na przedmiot, lecz jest silnie skupiana przez soczewkę obiektywową (choć z racji funkcji, jaką pełni, powinna być również nazywana soczewką kondensorową!). Mocno skoncentrowana wiązka elektronów, tzw. elektronów pierwotnych, bombarduje powierzchnię preparatu krok po kroku (punkt po punkcie), skanując powierzchnię przedmiotu w płaszczyźnie X-Y (ryc. 1.1.11A SEM). W wyniku powyższego bombardowania obraz preparatu powstaje na bazie efektów wtórnych pojawiających się na jego powierzchni, dzięki oddziaływaniu elektronów pierwotnych z atomami przedmiotu. I tak najczęściej wykorzystywanym podczas obrazowania materiałów biologicznych efektem jest generowanie elektronów wtórnych (ang. secondary electrons; SE), które powstają w wyniku jonizacji atomów przedmiotu. SE są niskoenergetycznymi elektronami, toteż do ich rejestracji wykorzystuje się dodatnio naładowane detektory, aby przyciągnąć ujemnie naładowane SE do ich czułych powierzchni. Z punktu widzenia powstawania obrazów natężenie SE docierających do detektora zależy od topografii preparatu. Części wypukłe, wyeksponowane do detektora są doskonałymi emiterami SE, dając mocny sygnał. Części wklęsłe natomiast, choć uwalniają SE, to ich rejestracja jest utrudniona ze względu na pochłanianie SE przez materiał. Uchwycony przez detektor SE sygnał jest następnie wzmacniany i przekazywany jako impuls elektryczny do komputera, gdzie formowany jest obraz. Kontrast powstającego obrazu odzwierciedla topografię przedmiotu, gdyż zależy od różnicy w mocy sygnałów pochodzących od różnie położonych punktów na powierzchni przedmiotu (ryc. 1.1.11C). Obraz jest prezentowany w skali szarości, stosownie do natężenia SE pochodzących z owych powierzchni; nigdy nie jest kolorowy!

TEM i SEM, dla zapewnienia swobodnego przebiegu elektronów, musi działać w próżni. Toteż kolumna mikroskopowa z optyką elektromagnetyczną, a w szczególności źródło elektronów, pracują w warunkach bardzo niskiego ciśnienia wytwarzanego przez pompy próżniowe rotacyjne, dyfuzyjne, jonowe i turbomolekularne.

Pierwiastki, które wchodzą w skład preparatów biologicznych, należą w przeważającej większości do pierwiastków lekkich: H, C, N i O, ze zmienną ilością pierwiastków o nieco większej liczbie atomowej: Na, Mg, P, S, Cl, K czy Ca. W celu uzyskania optymalnego kontrastu obrazu preparaty biologiczne są najczęściej traktowane solami metali ciężkich, np.: Os, Pb, U. Sole metali ciężkich, którymi „barwi” się komórki lub tkanki, akumulują się wybiórczo na niektórych składnikach komórkowych, takich jak lipidy, białka, glikogen lub kwasy nukleinowe. Podczas obrazowania elektrony uginają się na atomach wspomnianych metali ciężkich i w efekcie powstaje znacznie kontrastowy obraz komórki, niż miałoby to miejsce bez „barwienia”. Dodatkowo duża liczba Z pierwiastków budujących materiał skutkuje większą emisją elektronów wtórnych (SE) oraz elektronów wstecznie rozproszonych (ang. backscattered electrons; BSE), co zwiększa kontrast obrazów SEM.

BSE są elektronami ugiętymi w polu elektromagnetycznym jąder atomów preparatu, które zawracają i mogą być rejestrowane przez detektory półprzewodnikowe umieszczone tuż pod soczewką obiektywu mikroskopu. W przeciwieństwie do SE, BSE niosą duży zasób energii, a więc obrazy przez nie generowane są odmiennego charakteru i intensywności. Ponadto dzięki silnemu związkowi między natężeniem BSE i średnią liczbą atomową pierwiastków (Z) możliwe jest identyfikowanie odmiennych w składzie pierwiastkowym regionów przedmiotu, nawet jeśli preparat jest zupełnie płaski (ryc. 1.1.12A i C). Rutynowo, rejestracja obrazów w oparciu o BSE jest częściej stosowana w naukach geologicznych i materiałowych niż w biologicznych, jednak w przypadku obrazowania płaskich preparatów (np. szlifów tkanek twardych), jest to doskonały sposób na obserwacje lokalnych zmian w składzie pierwiastkowym. Ostatnie lata przyniosły znaczący zwrot w wykorzystaniu BSE w obserwacji uprzednio kontrastowanych metalami ciężkimi tkanek zamkniętych w bloczkach żywicowych i przygotowanych w sposób typowy dla obserwacji TEM. SEM wyposażony w detektor BSE oraz ultramikrotom zamontowany w komorze preparatu pozwala na sekwencyjne skrawanie powierzchni bloczka z zatopioną tkanką (kilkadziesiąt nanometrów w głąb) i rejestrację obrazu odsłoniętej powierzchni. Technika seryjnego skrawania i obrazowania tkanek (ang. serial block-face scanning electron microscopy; SBF-SEM) jest w pełni zautomatyzowana i daje możliwość generowania trójwymiarowych obrazów obiektów o bardzo skomplikowanej strukturze i wzajemnych relacjach przestrzennych (np. połączenia nerwowe).

Modyfikacje mikroskopów elektronowych i ich dodatkowe wyposażenie. Przez kilkanaście lat poczyniono ogromny postęp w kierunku obrazowania materiałów biologicznych uwodnionych. W przypadku obu typów mikroskopów elektronowych – SEM i TEM, materiał komórkowy lub tkankowy może być utrzymywany w warunkach kriogenicznych, w temperaturze około –190ºC. Jednak dla zachowania właściwej struktury uwodnionej tkanki bądź komórki ważne jest wcześniejsze zamrożenie obiektu w sposób ograniczający do minimum formowanie się kryształów lodu – witryfikacja wody. W przypadku SEM zamrożony materiał może być bezpośrednio umieszczony w komorze preparatów mikroskopu, gdzie chłodzony ciekłym azotem (LN₂) stolik utrzymuje jego niską temperaturę. Sposób obrazowania powierzchni materiału jest identyczny do przedstawionego wcześniej. Niejednokrotnie zamrożone tkanki przełamuje się (ang. freeze-fracture) w komorze preparatu umieszczonym tam ostrzem, aby odsłonić wewnętrzne struktury próbki. Następnie, dla zwiększenia kontrastu topograficznego materiału, podgrzewa się go delikatnie, pozwalając cząsteczkom wody sublimować (ang. etching). W TEM natomiast, jeśli obrazowanie dotyczy grubych biopsji tkankowych, materiał musi być uprzednio skrawany w niskiej temperaturze i dopiero otrzymane skrawki umieszczane są w kriogenicznej komorze preparatu. Obserwacje mogą być dalej prowadzone w warunkach kriogenicznych, ale często, dla zwiększenia kontrastu między strukturami komórkowymi, skrawki poddaje się liofilizacji w kolumnie mikroskopu (ang. freeze-drying). Zewnątrzkomórkowe pęcherzyki, cząsteczki i kompleksy białkowe czy cytoplazma peryferyczna silnie adherentnych komórek może być z powodzeniem obserwowana bezpośrednio po mrożeniu materiału (ryc. 1.1.12B i D).

RYC. 1.1.12. Elektronogramy z mikroskopu elektronowego skaningowego (SEM; Zeiss Sigma VP) (A) i transmisyjnego (TEM; JEOL JEM2100 HT Cryo) (B). Obraz SEM kryształów kwarcu powstały dzięki detekcji elektronów wtórnych (SE; topografia) i wstecznie rozproszonych (BSE). Zmienna liczba Z pierwiastków obecnych w kryształach ujawnia się dzięki BSE. Rejony ciemniejsze świadczą o niewielkiej liczbie Z, podczas gdy jasne partie kryształów zawierają pierwiastki o dużej Z. Skala: 100 μm (C). Obraz TEM egzosomów izolowanych z krwi obwodowej człowieka, przygotowanych kriogenicznie i obserwowanych w temperaturze –190°C. Skala: 0,2 μm (D) (zdjęcia mikroskopów dzięki uprzejmości firmy Carl Zeiss Polska Sp. z o.o. i JEOL Europe SAS).

Innym sposobem obserwacji uwodnionych obiektów biologicznych jest wykorzystanie SEM pracującego w trybie zmiennej próżni (ang. low vacuum [variable pressure] SEM; LV-SEM; environmental SEM; ESEM). Budowa i optyka mikroskopu nie różni się zasadniczo od klasycznego SEM, jednak posiada dwa kluczowe dla niego elementy, tzw. przysłony próżniowe oraz komorę preparatu połączoną ze źródłem gazu, najczęściej pary wodnej. Przysłony próżniowe pozwalają na utrzymanie dużej różnicy ciśnień między komorą preparatu (np. 3000 Pa), optyką mikroskopu i komorą działa elektronowego (np. 10–6 Pa). Obecność gazu (pary wodnej) w komorze preparatu to nie tylko sposób na utrzymanie obiektu w stanie uwodnionym, w wysokim ciśnieniu, lecz także umożliwienie obserwacji bez potrzeby pokrywania materiału warstwą przewodnika (patrz rozdział 1.2.2. Urządzenia peryferyczne). Tutaj jonizowane elektronami pierwotnymi cząsteczki wody znoszą powstający w preparacie ujemny ładunek elektryczny. Dodatkowo obecność cząsteczek wody sprzyja wzmocnieniu sygnału elektronowego powstającego na powierzchni obserwowanego materiału. LV-SEM prócz swoich zalet związanych z niemal przyżyciową obserwacją drobnych organizmów i uwodnionych tkanek ma ograniczoną zdolność rozdzielczą. Cząsteczki gazu obecne w komorze preparatu powodują rozpraszanie elektronów pierwotnych koncentrowanych przez obiektyw, toteż średnica wiązki elektronów skanująca powierzchnię materiału jest znacznie większa niż w układzie SEM z wysoką próżnią. To rzutuje na jakość obrazów najdrobniejszych obiektów. Niemniej jednak jest to niezwykle cenna technika mikroskopowa, gdy przygotowanie uwodnionego materiału biologicznego jest utrudnione, preparat zawiera wysoce lotne związki lub obserwacje wymagają utrzymania materiału w fazie ciekłej. Obserwacje materiału biologicznego w formie natywnej, uwodnionej wydają się możliwe również w TEM. Istnieją bowiem rozwiązania komór preparacyjnych mikroskopu, które izolują skutecznie obserwowaną próbkę od wysokiej próżni panującej w kolumnie mikroskopu. Trzeba jednak pamiętać, że nadal preparat musi być przeźroczysty dla elektronów (ultracienki) i wytrzymać duże natężenie prądu elektronowego wiązki pierwotnej.

Obserwacje SEM preparatów w stanie uwodnionym są również możliwe w systemie WET-SEM (ang. WET – wilgotny). Uwodniony materiał komórkowy lub tkankowy umieszcza się w specjalnej kapsule zamkniętej z jednej strony cienką przeźroczystą dla elektronów błoną (najczęściej z SiN₄). Komórki i tkanki utrwala się i kontrastuje solami metali ciężkich dla wzmocnienia sygnału bądź immunoznakuje drobinami złota interesujące badacza struktury. Obserwacje preparatu prowadzi się w klasycznym SEM jednak „przez błonę”, z wykorzystaniem detekcji BSE. Zdolność rozdzielcza techniki nie jest może imponująca, ale umożliwia pominięcie etapu odwadniania próbki, a więc uniknięcie potencjalnych artefaktów strukturalnych wynikających z suszenia.

Wspomniano wyżej, że technika SBF-SEM pozwala na tworzenie trójwymiarowych rekonstrukcji struktur komórkowych, komórek oraz zespołów komórkowych, dzięki skrawaniu i obrazowaniu odsłoniętego fragmentu preparatu. Podobne trójwymiarowe rekonstrukcje wykonuje się w oparciu o SEM, lecz z wykorzystaniem seryjnych skrawków (ang. serial section SEM; SSEM). Preparat przygotowany jest w sposób identyczny jak do obserwacji TEM, zatopiony w żywicy i cięty przy pomocy zautomatyzowanego ultramikotomu na cienkie, kilkunastonanometrowej grubości skrawki. Skrawki są układane w formie taśm na krzemowych podkładkach i kolejno ich obrazy rejestrowane cyfrowo. Obrazy składane są następnie komputerowo w projekcje 3D, które ujawniają przestrzenny rozkład struktur komórkowych i wzajemne relacje między komórkami.

Obrazy trójwymiarowe są uzyskiwane także w TEM. Dla większych struktur komórkowych, np. organelli komórkowych, stosuje się rejestracje tomograficzne. W tym przypadku umieszczony w mikroskopie ultracienki skrawek zawierający interesującą badacza strukturę obrazuje się, zmieniając kąt położenia obiektu względem wiązki elektronowej, najczęściej od –70° do +70°. Uzyskane obrazy składa się następnie w jedną trójwymiarową projekcję. Choć tomografia elektronowa jest bardzo wymagająca i niesie ze sobą sporo ograniczeń, to uzyskane dane przestrzenne znacząco pomagają w rozumieniu budowy organelli i relacji między elementami komórkowymi. W przypadku kompleksów białkowych (np. kompleksu poru jądrowego) stosuje się techniki kriotomografii elektronowej oparte na obrazowaniu przypadkowo ułożonych względem wiązki elektronowej obiektów. Badane kompleksy są izolowane z komórek i oczyszczane, a uzyskana frakcja zamrażana bezpostaciowo (witryfikacyjnie) w roztworze osadzonym na specjalnie przygotowanych błonach do TEM. W warunkach kriogenicznych, w sposób zautomatyzowany, rejestrowane są setki/tysiące obrazów kompleksów ułożonych pod przypadkowymi kątami, z rozdzielczością przestrzenną nanometryczną. Zdjęcia są składane wreszcie w trójwymiarowy obraz strukturalny. Dzięki tej technice możliwe jest uzyskanie informacji o budowie pojedynczych cząstek budujących elementy komórkowe i wzajemnych interakcjach między nimi i innymi elementami większych kompleksów.

Do kolumn SEM i TEM można również instalować dodatkowe układy detekcyjne, które prócz SE i BSE odbierają inne sygnały generowane podczas bombardowania preparatu elektronami pierwotnymi. W biologii, dla oceny składu pierwiastkowego preparatu, wykorzystuje się rejestrację charakterystycznego promieniowania X. Promieniowanie X charakterystyczne niesie ze sobą energię, która definiowana z pomocą półprzewodnikowych detektorów umożliwia określenie jakościowe pierwiastków, a natężenie odebranego promieniowania X mówi o ilości pierwiastka w próbce. Pomiar składu pierwiastkowego prowadzi się równocześnie z obserwacją umieszczonego w mikroskopie preparatu, co daje możność wyboru konkretnego miejsca analizy. Trzeba jednak pamiętać, że przygotowanie komórek i tkanek do pomiarów pierwiastkowych może odbywać się wyłącznie technikami kriogenicznymi.